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보고서 상세정보
본 발명은 pH 민감성 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산 복합 하이드로젤 및 그 제조방법에 관한 것이다. pH 민감성 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산 복합 하이드로젤 및 그 제조방법{pH sensitive Hydroxyethyl Cellulose-Hyaluronic Acid Complex Hydrogel and Method of Preparing the Same} 본 발명은 pH 민감성 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산 복합 하이드로젤 및 그 제조방법에 관한 것이다. 하이드로젤은 일반적으로 히알루론산(HA), 콜라겐, 젤라틴, 셀룰로오스와 같은 천연 고분자로 구성되며, 친수성 고분자 사슬의 3차원 네트워크 구조를 형성한다. 팽윤(Swelling)된 하이드로젤은 3차원 네트워크 구조가 분해되지 않고 많은 양의 수분을 흡수한다. 또한 피부에서 조직, 세포 외 매트릭스(ECM)와 유사한 특유의 기계적, 구조적 특성을 가진다. 하이드로젤의
특이적인 물리적 특성에 따라 조직공학, 약물전달시스템, 이미징, 치료, 의학 장치 등을 위한 생체적합재료로써 사용된다. 셀룰로오스는 글루코스 유래 천연 고분자로 생체적합성, 낮은 가격, 생분해성, 무독성, 세균 억제의 특성으로 그 수요가 증가하고 있다. 그러나 물이나 다른 유기 용매에 잘 용해되지 않는 단점이 있어 이러한 결함을 극복하기 위해 셀룰로오스를 기반으로 한 메틸셀룰로오스(methylcellulose:MC), 하이드록시프로필메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose:HPMC), 에틸셀룰로오스(ethyl cellulose:EC), 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethyl cellulose:HEC), 소듐 카복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose:NaCMC)와 같은 유도체들이 개발되었다. 이러한 고분자들은 독성이 없기 때문에 약학이나 화장품 산업에서 유화제나 점증제와 같이 다양하게 이용되고 있다. 특히
pH에 민감한 고분자 중 하나인 소듐 카복시메틸셀룰로오스는 카복실산 그룹이 중성이나 알칼리 용액에서 이온화 되는 특성을 가지므로 다양한 용도로 사용되고 있다. 히알루론산(이하 HA)은 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)과 글루쿠론산(glucoronic acid) 두 개의 반복 단위가 β-1,4 결합으로 연결된 선형의 다당류이다. HA의 카복실기의 pKa는 3-4이며, 이 작용기는 pH 7에서 이온화된다. HA은 표피에서 세포 증식, 이동, 분화 과정을 조절하고, 진피조직의 생리적 기능을 조절하는 세포 외 매트릭스(ECM)의 주요성분으로써 피부에서 중요한 역할을 한다. 또한, HA은 펩타이드, 매트릭스 단백질, 성장 인자들과 결합할 수 있다. 데르마탄 설페이트, 케라틴 설페이트와 같은 다른 글리코사미노글리칸과 달리, HA은 유일한 비설페이트 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan:GAGs)이다. HA은 친수성 고분자로 많은 양의
수분과 결합할 수 있으며, 고체 부피 보다 약 1000배까지의 수분을 포함할 수 있다. 이는 카복실기와 N-아세틸기에서 수소결합이 발생하므로 HA는 형태적으로 단단하면서 수분을 보유할 수 있다. 이처럼 HA가 특유의 물리화학적 성질, 생체적합성, 무독성과 생분해성을 가지므로 안구, 성형, 조직 공학, 약물 전달과 같은 의학적 분야에서 널리 응용되어 사용되고 있다. 특히 HA는 피부에 대한 항노화와 수분 공급을 위한 화장품 성분으로 사용되고 있으며, HA 필러는 노화에 의해 발생하는 주름을 채우기 위한 미용시술에 사용되고 있다. 이소리퀴리티게닌(Isoliquiritigenin)은 감초의 구성 성분 중 하나로 중국과 다른 동남부 아시아에 분포하며 의료용 약제로써 사용된다. 많은 연구들이 암세포 성장 억제, 프로스타글란딘 E2와 산화질소 감소, 타이로신 저해제로의 이소리퀴리티게닌의 효과를 확인하였다. 또한 B. subtilis , P.
acnes , P. aeruginosa에 대한 항균 활성은 다른 감초 성분(glycyrrhizin, liquiritin, liquiritigenin) 보다 우수하였다. 게다가 한국산 감초의 에틸 아세테이트 추출물은 중국과 우즈베키스탄과 같은 다른 지역에 비하여 다량의 이소리퀴리티게닌을 포함하는 것으로 나타났다. 피부는 신체를 덮고 있는 가장 외부의 조직으로 유해 환경으로부터 체내를 보호하고 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 하고 있다. 그 중 가장 최외각층에 위치하는 각질층은 외부의 유해 물질들에 대한 장벽역할을 수행한다. 하지만 이러한 방어망은 경피를 통한 약물 전달에 있어 방해요소로 작용된다. 약물의 작용을 극대화 하기 위해 피부 침투는 매우 중요하며, 이를 위한 효과적인 피부 전달 시스템의 개발이 요구되고 있다. 각질층의 pH는 약 5.5으로 이러한 약산성 환경은 효과적인 장벽 기능과 피부의 항상성 유지를 위한 중요한
조건이다. 각질층의 산성막이 파괴되는 경우 피부장벽 교란과 세균 번식으로 인한 여러 가지 피부 질환이 유발될 수 있다. 여드름, 아토피, 피부 건조 등의 피부는 정상보다 높은 pH 환경을 가지며, pH 불균형 상태는 이러한 피부 병변의 효과적인 치료와 방지를 위해 고려되어야 할 요소이다. 본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명은 효과적인 pH 민감성 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산 복합 하이드로젤 및 그 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다. 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수산화 나트륨 수용액에 하이드록시에틸셀룰로오스와 히알루론산을 용해시킨 후 디비닐술폰(divinyl sulfone:DVS)을 처리하여 제조된 pH 민감성 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산 복합 하이드로젤을
제공한다. 또한, 본 발명은, 상기 하이드로젤 및 생리 활성 성분을 유효성분으로 포함하는 피부 투과용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은, 수산화 나트륨 수용액에 하이드록시에틸셀룰로오스와 히알루론산을 용해시킨 후 디비닐술폰(divinyl sulfone:DVS)을 처리하는 단계를 포함하는, pH 민감성 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산 복합 하이드로젤의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 pH 민감성 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산(이하 HEC-HA) 복합 하이드로젤은 주변 pH에 따라 약물 방출을 제어할 수 있는 스마트 하이드로젤 시스템으로, 소재가 가지고 있는 작용기가 pH에 따라 변화하는 것을 이용하여, 정상보다 증가된 pH 환경을 갖는 여드름, 아토피, 건조, 민감성 피부에서 pH 변화에 따라 약물 방출이 제어되는 스마트 시스템이다. 본 발명에서는 약물로 천연물인 감초에서
유래한 성분인 이소리퀴리티게닌 이용하였다. 따라서 중성 또는 알카리성 피부에서 특이적으로 약물 전달 효과가 증가하였고, 특히, 여드름균에 대한 항균 활성을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 복합 하이드로젤을 이용한 약물 방출을 제어할 수 있는 능력을 확인함으로써 특정 pH에서 약물 및 수분을 방출할 수 있고, 특정 병변을 타겟팅할 수 있어 효능 손실을 줄일 수 있기 때문에 약물의 경피 전달에 있어 효율적인 피부 전달체로 이용 가능성이 있는 장점을 갖는다. 본 발명에서는 하이드로젤의 재료로 생체적합성이 뛰어난 무독성의 생분해성 소재인 하이드록시에틸셀룰로오스와 히알루론산을 사용하였고, 특히 히알루론산의 카르복실기를 이용하여 pH에 따른 약물 방출 조절할 수 있다. 게다가, 히알루론산은 수분 보유력이 우수하여 보습 효과를 증가시키는 효과를 갖는다, 또한, 하이드록시에틸셀룰로오스를 사용함으로써 하이드로젤의 점착력이 향상되는 효과를 갖는다. 상기의 하이드록시에틸셀룰로오스와 히알루론산의 질량 비율을 조절함으로써 하이드로젤의 기계적 특성을 향상시켜 마스크 팩 또는 패치 등으로 적인 사용이 가능하므로 약물 전달 기능을 향상시켜 화장품 제조업 또는 제약업 등에서 응용 가능성을 증가시킬 수 있는 효과를 갖는다. 도 1은 HEC-HA 복합 하이드로젤의 합성 기작을 나타내었다. 이하 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다. 본 발명은 수산화 나트륨 수용액에 하이드록시에틸셀룰로오스와 히알루론산을 용해시킨 후
디비닐술폰(divinyl sulfone:DVS)을 처리하여 제조된 pH 민감성 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산 복합 하이드로젤에 관한 것이다. 상기 pH 민감성 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산 복합 하이드로젤에서, 하이드록시에틸셀룰로오스: 히알루론산은 3:1 내지 1:99의 질량 비율인 것이 바람직하고, 하이드록시에틸셀룰로오스: 히알루론산이 1:3의 질량 비율인 것이 더욱 바람직하다. 상기의 질량 비율로 혼합될 경우, 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산 복합 하이드로젤은 최적의 수분보유력과 점착력의 효과를 나타낼 수 있다. 상기 범위를 벗어나서 제조되는 경우에는 마스크 팩 등 국소용으로 제조 시 하이드로젤이 부서질 수 있는 단점이 발생할 수 있다. 본 발명의 HEC-HA 복합 하이드로젤은 화학적 가교제로 디비닐술폰(divinyl sulfone:DVS)을 이용하여 가교할 수 있고, 본 발명의 일 구현 예에서 DVS는 HA의 반복단위와의 몰비가 1:1이 되도록 넣어주었다. HEC-HA 복합 하이드로젤에서 최종 고분자의 농도는 3% 이며, HEC와 HA의 하이드록실기(hydroxyl group)는 pH 13에서 Michael 첨가 반응을 통해 디비닐기(divinyl group)에 의해 가교되었다. 도 1은 HEC-HA 복합 하이드로젤의 합성 기작을 나타내었다. DVS는 높은 반응성을 가지며 독성이 있는 물질로 알려졌지만, DVS에 의해 제조된 하이드로젤의 생체 친화성은 많은 연구에서 확인되었다. 상기의 HEC-HA 복합 하이드로젤은 외부 pH 인자에 반응하는 고분자를 이용하여 제조되는 스마트 하이드로젤의 일종이다. 스마트 하이드로젤은 외부 인자에 노출되었을 때 다공성과 친수성이 변화하는 특성을 가지며, 이는 약물의 포집과 방출을 조절하는데 이용될 수 있다. 고분자 기본구조에 특정 작용기가 포함된 고분자로 제조된 상기 스마트 하이드로젤은 수소결합, 친수성 또는 π-π 상호작용, 정전기적 인력 등의 비공유 상호작용에
의해 반응하도록 설계되었다. 따라서 상기 스마트 하이드로젤은 특정 조건에 따라 약물의 방출 조절이 가능함으로써, 약물 전달 시스템으로써의 유용한 특성을 갖는다. 또한, 본 발명은 상기 하이드로젤 및 생리 활성 성분을 유효성분으로 포함하는 피부 투과용 조성물에 관한 것이다. 상기 생리 활성 성분은 피부 미백제, 항노화제, 항산화제, 항균제, 항염증제, 피부 건조증 치료제, 약물, 천연물 추출물 또는 플라보노이드인 것을 특징으로 할 수 있고, 특히 상기 플라보노이드는 천연물인 감초에서 유래한 성분인 이소리퀴리티게닌(Isoliquiritigenin)인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산 복합 하이드로젤을 이용한 피부 투과용 조성물은 pH가 6 내지 10인 범위에서, 더욱 바람직하게는 pH가 7 내지 9인 범위에서 생리 활성 성분의 방출이 증가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 주변 pH에 따라 약물
방출을 제어할 수 있으며, 구체적으로 소재가 가지고 있는 작용기가 pH에 따라 변화하는 것을 이용하여, 정상보다 증가된 pH 환경을 갖는 여드름, 아토피, 건조, 민감성 피부에서 pH 변화에 따라 약물 방출이 제어되는 시스템이다. 따라서 중성 또는 알카리성 피부에서 특이적으로 약물 전달 효과가 증가할 수 있고, 특히, 여드름균에 대한 항균 활성을 확인하였다. 따라서 약물 방출을 제어할 수 있어 특정 pH에서 약물 및 수분을 방출할 수 있고, 특정 병변을 타겟팅할 수 있음으로 인해 효능 손실을 줄일 수 있기 때문에 약물의 경피 전달에 있어 효율적인 피부 전달체로 이용 가능성을 갖는다. 또한, 본 발명은 수산화 나트륨 수용액에 하이드록시에틸셀룰로오스와 히알루론산을 용해시킨 후 디비닐술폰(divinyl sulfone:DVS)을 처리하는 단계를 포함하는, pH 민감성 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산 복합 하이드로젤의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 pH 민감성 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산 복합 하이드로젤에서, 하이드록시에틸셀룰로오스: 히알루론산은 3:1 내지 1:99의 질량 비율인 것이 바람직하고, 하이드록시에틸셀룰로오스: 히알루론산이 1:3의 질량 비율인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 복합 하이드로젤의 제조 방법에 있어 가교제로는 디비닐술폰(divinyl sulfone:DVS)을 사용할 수 있고, 상기 DVS는 히알루론산과 동일한 몰비율로 첨가할 수 있다. 상기 기재된 내용 이외에 본 발명의 pH 민감성 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산 복합 하이드로젤의 제조 방법에 기재된 구체적인 설명은 본 명세서에서 pH 민감성 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산 복합 하이드로젤에 대하여 설명한 내용을 원용한다. 이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은
당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변경 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다. 본 발명에서 사용된 히알루론산(Hyaluronic acid:HA)은 바이오랜드(korea)에서 제공받았으며, HA 분자량(Mw)은 약 0.8 Mda인 것을 사용하였다. HEC(Mw = 90,000), 디비닐술폰(divinyl sulfone:DVS), Nile red(BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%), 염화나트륨(Sodium chloride:NaCl), Sodium phosphate dibasic dodecahydrate (Na2HPO4·12H2O) 그리고 이소리퀴리티게닌 (Isoliquiritigenin)은 모두 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. Sodium hydroxide(NaOH, assay=98.0%)와
Hydrochloric acid(HCl, assay=35.0%)는 OCI사 (Seoul, Korea) 에서 구매하였고, sodium dihydrogenphosphate dihydrate는 Junsei Chemical(Tokyo, Japan)에서 구매하여 사용하였다. 1,3-butylene glycol(1,3-BG)와 ethanol은 추가 정제 없이 사용하였으며, P. acnes ATCC6919는 한국 미생물 보존센터(KCCM, Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. Clostridial agar와 medium는 Becton, Dickinson and Company(BD, USA)에서 구매하여 사용하였으며, 증류수는 Milli-Q로 정제하여 사용하였다. 실시예 1. 하이드록시에틸셀룰로오스 -히알루론산( HEC -HA) 복합 하이드로젤 제조 하이드록시에틸셀룰로오스-히알루론산(HEC-HA) 복합 하이드로젤은 HEC와 HA의 질량 비율을 100:0, 75:25, 50:50, 25:75, 0:100으로하여 제조하였고, 이를 각각 HECHA10, HECHA31, HECHA11, HECHA13, HECHA01으로 명명하였다. HEC와 HA 무게 측정 후, 교반기를 사용하여 0.02M의 NaOH 용액 10ml에 완전히 용해시켰다(rpm 250, 약 1시간 반, 상온). 이 후 DVS를 HA의 반복단위와 동일한 몰 비율인 1:1로 첨가하였다. 하이드로젤의 화학적 가교제로 사용된 DVS는 in vitro, in vivo에서 모두 생체 적합성을 나타내었다. 12시간 동안 인큐베이션 시킨 후, 반응하지 않은 가교제와 반응물을 제거하고, pH를 중화시키기 위해 가교된 하이드로젤을 정제수로 반복 세척하였다. 이후 실험을 위해
하이드로젤은 약 1cm X 1cm X 0.5cm(넓이, 길이, 높이)로 절개하였고, lyophilizer(-60 ℃, 5mmTorr, 3days Ilshinbiobase, Korea)를 사용하여 3 일 동안 동결 건조하였다. 실시예 2. HEC -HA 복합 하이드로젤의 특성 측정 HCE와 HA 그리고 건조된 하이드로젤은 FT-IR(Nexus Nicolet FT-IR, Thermo Scientific, Idstein, Germany)을 통해서 확인하였다. Smart Orbit ATR accessory인 diamond crystal 와 Omnic 8.0 software를 사용하여 400 ~ 4000 cm-1 범위에서 32번 스캔하여 측정하였다. 건조된 하이드로젤의 표면 형태는 20kV 가속전압의 SEM(TESCAN VEGA3, Cranberry TWP. PA, USA)에 의해 확인되었으며, 건조된 하이드로젤의 cross-section은 면도칼을 이용하였다. 내부 구조(cross-section)는 금으로 코팅되었고 이 후 관찰하여 촬영하였다. HECHA 하이드로젤의 열적 중량 분석은 JP/DTG-60(Shimadzu, Tokyo, Japan)을 이용하여 공기 중에서 속도 60mL/min, 가열속도 10℃/min으로 25 ~ 250℃ 온도 범위에서 초기 무게 7.4mg으로 진행하였다. 표준물질은 α-Alumina powder를 사용하였다. 실시예 3. HEC -HA 복합 하이드로젤의 팽윤(swelling) 비율 측정 HEC-HA 하이드로젤의 swelling 비율(SR)은 체온과 생체의학적 응용을 가장하기 위해 37℃의 일정한 온도에서 pH 변화에 따라 측정되었다. 건조된 하이드로젤(Hd, 초기 무게 0.02g)을 1에서 13 범위의 다른 pH의 용액에 각각 넣어주었다. pH 용액은 HCl과 NaOH 용액을 이용하여 조절하였으며, pH 미터기(Mettler Toledo, seven compact, Gießen, Germany)로 측정하였다. 24시간 후, swelling된 하이드로젤을 꺼내고 표면에 있는 물기만을 조심스럽게 제거한 뒤 그 무게를 측정하였다(Hw). 하기 [수학식 1]을 이용하여 하이드로젤의 swelling 비율(SR)을 계산하였다. [수학식 1] SR (%) = (Hw - Hd) / Hw x 100 상기 [수학식 1]에서 Hw는 swelling된 하이드로젤의 무게(g)이고,
Hd는 건조된 하이드로젤의 무게(g)이다. 실시예 4. HEC -HA 복합 하이드로젤의 유변학적 및 기계적 특성 측정 HEC-HA 하이드로젤의 유변학적 특성은 TA HR-1 rheometer(TA instruments, Leatherhead, UK)를 사용하여 직경 40mm의 원판으로 측정하였다. 모든 샘플은 전단력을 최소화하기 위해 조심스럽게 펠티에 판 위에 올려졌다. 모든 유변학적 연구는 25℃에서 진행하였다. 하이드로젤은 달라지는 전단응력에 의해 변형되므로 10% 이내로 된 선형의 점탄성 영역을 얻기 위해 oscillatory strain sweep test를 진동수 1 Hz에서 실시하였다. 최대 응력은 1%로 얻어졌고, HECHA 하이드로젤의 동적 전단 저장 탄성율(G’)과 손실 탄성율(G”)이 각진동수 0.1 - 10 rad/s에서 측정되었다. HECHAs 하이드로젤의 기계적인 특성을 확인하기 위해 texture analyzer(TA.XT Express Enhanced, Stable Micro Systems, Godalming, Surrey, UK)를 사용하였다. 이것은 5kg의 로드셀을 장치하고 있으며, 강도, 응집성, 점착성을 측정하기 위해 사용되었다. 40mm 디스크가 하이드로젤을 압축시키고, 변형시켰다(target mode: strain, strain: 20%). 전, 후 그리고 시험 속도는 2.00 mm/sec으로 설정하였다. 프로브는 겔의 표면 위에 놓여졌다. 실시예 5. HEC -HA 복합 하이드로젤의 약물 포집 및 방출 효율 측정 HEC-HA 하이드로젤의 약물 포집효율을 평가하기 위해 건조된 하이드로젤(초기 무게 0.02g)을 500 μM ILTG을 포함한 20% 1,3-BG 용액 3ml에 swelling 시켰다. ILTG은 빛에 민감하기 때문에 이 연구는 37℃에서 12시간 동안 암실에서 진행되었다. 포집 효율은 high-performance liquid chromatography(HPLC; Shimadzu, Tokyo, Japan)에 의해 측정된 ILTG의 검정곡선에 의해 분석되었다. HPLC 장치는 20AT pump, SPE-M20A UV-Vis detector 그리고 Ship-pack (VP-ODS) C18 analytical column (5 μm, 25094.6 mm)으로 구성되었다. 이동상은 2% (v/v) acetic acid in distilled water 와 0.5%
(v/v) acetic acid in 50% (v/v) acetonitrile의 혼합물이었으며, 372 nm 파장에서 유속 1.0 mL/min로 확인하였다. 하기의 [수학식 2]는 하이드로젤 매트릭스에 포집된 ILTG의 포집 농도를 계산하기 위해 사용되었다. [수학식 2]  IE 포집효율 V1 ILTG을 포함한 1,3-BG 용액의 초기 부피 (mL); V2 ILTG을 포함한 1,3-BG 용액의 남아있는 부피 (mL); C1 ILTG의 초기 농도 (μg/mL); C2 ILTG의 남은 농도 (μg/mL). 약물 방출 효율은 HCl과 NaOH 용액에 의해 조절된 1에서 13까지 범위의 다양한 pH 용액에서 평가되었다. ILTG을 포집한 HECHA 하이드로젤은 상온, 암실에서 20% 1,3-BG 용액에서 24시간 방출되었다. 24시간 후, 20% 1,3-BG 용액에서 ILTG의 농도는 HPLC로 분석되었다. 실시예 6. HEC -HA 복합 하이드로젤의 항균 활성 측정 P. acnes는 ILTG을 포집한 HECHA 하이드로젤의 항균활성을 위한 균으로 선택되었다. 액체 배지는 pH 6~9 범위의 제조되었다. ILTG을 포집한
하이드로젤의 약물을 방출시키기 위해 24시간 상온에서 액체 배지에 담갔다. 24시간 후, 하이드로젤은 제거하고 동일한 양의 P. acnes의 콜로니 형성 단위(CFU)를 24시간 동안 혐기성 조건에서 37℃ 액체 배지에서 배양하였다. 배양이 종료된 후, 50 μL의 액체배지를 37℃의 평면의 고체 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 항균 활성은 평면 배지에서 콜로니의 크기와 그 수를 확인하였다. 실시예 7. 공초점 주사 레이저 현미경( CLSM )을 이용한 In vitro 피부투과 연구 피부전달 시스템으로써의 가능성을 확인하기 위해, HEC-HA 복합 하이드로젤은 CLSM (LSM 5 Exciter, Carl Zeiss, Jena, Germany) 분석 전에 0.02%의 Nile red
용액에서 swelling 시켜 제조하였다. CLSM 사진은 LSM Image Browser software, version 4.2.0.121(CarlZeiss Microimaging, Gottingen, GMBH)으로 평가하였다. CLSM 이미지는 differential interference contrast(DIC) 모드, 형광 모드, 혼합 모드에서 얻었다. 쥐(8 weeks, female)로부터 등 피부를 얻었으며, 표피, 진피를 제외한 피하 지방층은 조심스럽게 제거된 뒤 -70℃에 보관되었다. 피부는 상온에서 녹인 뒤, 실험 전에 PBS 용액으로 재수화 시켰다. 2cm x 2 cm 크기의 피부는 Franz diffusion cell 의 donor와 receptor phase 사이에 놓았으며, 표피 부분이 donor쪽을 향하도록 하였다. Receptor phase는 PBS, ethanol, HCO-60(polyoxyl (60) hydrogenated castor oil)이
78:20:2 (w/w/w %)으로 구성되었다. 실험 진행 동안 receptor phase는 150 rpm으로 휘저었으며, 37℃로 유지되었다. HECHA 하이드로젤은 피부의 donor 부분에 적용되었다. 24시간 후, 피부를 Franz diffusion cell로부터 분리한 후, 피부 표면에 남은 불필요한 하이드로젤을 제거하기 위해 세척하였다. 피부조직은 -70℃에서 optimum cutting temperature (OCT) embedding matrix(CellPath Ltd., UK)를 이용해서 몰드를 제작하였다. 얼려진 피부 조직은 -20℃에서 약 10 μm 두께로 cryotome (CM1950, LEICA, Wetzlar, Germany)을 사용하여 수직으로 잘랐다. Nile red의 흡수 파장은 485nm, 방출 파장은 525nm으로 측정하였다. 상기 실시예의 결과는 하기와 같다. 하이드로젤 합성의 외관 및 합성 기작 HEC-HA 복합 하이드로젤은 화학적 가교제인 DVS로 가교하였고, DVS는 HA의 반복단위와의 몰비가 1:1이 되도록 넣어주었다. HEC-HA 복합 하이드로젤에서 최종 고분자의 농도는 3% 이며, HEC와 HA의 hydroxyl group은 pH13에서 Michael 첨가반응을 통해 divinyl group에 의해 가교되었다. 도 1은 HEC-HA 복합 하이드로젤의 합성 기작을 나타내었다. DVS는 높은 반응성을 가지며 독성이 있는 물질로 알려졌지만, DVS에 의해 제조된 하이드로젤의 생체 친화성은 많은 연구에서 확인되었다. HEC-HA 복합 하이드로젤의 외관은 도 2에서 나타내었다. 푸리에 변환 적외분광법 (FT-IR) FT-IR 분광학은 HEC, HA 그리고 DVS 사이의 가교반응을 확인하기 위해 사용하였으며, FT-IR은 반응기를 효과적으로 확인할 수 있는 분석 장치이다. HECHA 하이드로젤의 네트워크 시스템은 HA와 HEC의 FT-IR 스펙트럼과 비교 확인하였다(도 3). HECHA 하이드로젤 그리고 HEC, HA의 주요 peak는 하기 표 1의 특징적인 밴드로 확인되었다.
상기의 결과로부터 HECHA 하이드로젤은 HEC, HA의 FT-IR 스펙트럼의 특징을 나타내었다. 하지만 HECHA 하이드로젤은 가교반응에 의한
1287, 1325, 1138 cm-1에서의 새로운 peak가 확인되었으며, 이는 DVS가 HECHA 하이드로젤 제조에 기여하였음을 나타낸다. 또한 상대적인 피크 세기는 HEC와 HA의 질량비에 따라 변화되었다. 이러한 결과 HECHA 하이드로젤이 DVS에 의해 잘 형성되었음을 확인하였다. 주사 전자 현미경 분석 HECHA 하이드로젤의 형태학적 이미지는 SEM을 이용하여 확인하였다. HECHA 하이드로젤은 50μm에서 90μm 사이의 평균 기공 사이즈를 가진 마이크로사이즈의 다공성 구조를 보였다 (도 4). 게다가 HEC 비율이 증가함에 따라 다공성 구조는 물리적으로 더 강해 보이며, 균일한 다공성 패턴을 보였다. 반면 HECHA01 하이드로젤 구조는 불균일한 다공성 패턴이 나타났다. 다공성 구조는 수분 통로 역할을 할 수 있으며, 따라서 하이드로젤은 많은 양의 물을 흡수할 수 있어 높은 swelling
비율을 가진다. 그리고 하이드로젤에 포집된 물은 고분자 사슬과 직접적으로 상호작용하는 bound water와 거대한 기공을 채우는 free water로 구분된다. 열 중량 분석( TGA ) 열 중량 분석(Thermo Gravimetric Analysis:TGA)은 물질들의 다양한 특징을 확인하기 위해 사용되는 기술이다. TGA 곡선은 온도에 따른 함수로써 물질의 질량변화를 측정하여 다중 성분 물질의 성분 분석, 열적 안정도, 수분 함량과 같은 유용한 정보를 제공한다. 특히 약학, 식품, 화장품 성분에서의 수분함량은 중요한 특징이다. 본 발명에서의 TGA 곡선은 HECHA 하이드로젤의 수분 결합력, 수분 증발 속도 그리고 안정도를 평가하기 위해 사용되었다. HECHA 하이드로젤은 40℃에서 140℃로의 온도 변화에 따라 질량이 감소하는 유사한 곡선을 보였다(도
5). 이 현상은 하이드로젤 내의 수분 증발과 관련된 것이다. 약 50℃에서 HECHA 하이드로젤의 소량의 수분이 증발하기 시작하여, 150℃에서 HECHA 하이드로젤의 질량은 약 97%까지 감소하였다. 100℃에서 하이드로젤 질량 손실율을 비교할 때, 질량 손실은 다음과 같다: HECHA10(-64.59%) > HECHA31(-51.48%) > HECHA11(-37.97%) > HECHA13(-35.27%) > HECHA01(-31.35%). HA 비율이 증가함에 따라 질량감소 비율이 낮은 것을 확인할 수 있었고, 이러한 결과는 HA 고분자 사슬이 HEC 보다 더 강한 수소결합을 가져 물과 수소분자 사이에 더 강하게 상호작용하기 때문이다. 또한 이러한 강한 물과의 결합은 수분 증발 속도 또한 늦게 나타날 것이다. 추가적으로 HECHA13, 11, 31 하이드로젤(약 5%)은 HECHA10,01 하이드로젤 (약 3%) 보다 더 많은 잔여물을 나타냈는데, 이는
하이드로젤의 안정도에 영향을 미치는 HEC와 HA 혼합의 효과로부터 기인한 것이다. HEC -HA 복합 하이드로젤의 팽윤 비율(Swelling Ratio) 하이드로젤은 일반적으로 외부 용매에 노출되었을 때 팽윤(swelling)되는 특징을 가지고 있다. 이러한 swelling 거동은 주로 삼투압의 힘, 정전기적 힘 그리고 점탄성의 복원력과 관련되어 있다. 많은 연구들이 거시적, 미시적 이론을 기반으로 다양한 힘들의 영향에 대한 모델링 이론을 설명하였다. 예를 들어, 통계적인 이론은 고분자 전해질 겔의 전반적인 swelling 비율을 설명하며, 거시적 이론은 하이드로젤의 깁스 자유 에너지를 최소화 시키는 평형상태를 설명한다. 하이드로젤의 swelling 비율과 swelling 동역학에 대한 또 다른 중요한 요인은 다공성으로 기공의 크기와 다공성 구조가 영향을 미친다. 이러한 요인들과 관련하여 하이드로젤은 4가지 그룹으로 분류될 수 있다; non-pores(without network porosity), micro-porous(various porosity with closed-cell structure [0.01~0.1 μm]), macro-porous(Various porosity with closed-cell structure [0.1 ~ 1 μm]), 그리고 열린 시스템을 형성하는 것과 관련된 super-porous(range of several hundred micrometers) hydrogels(SPHs). SPHs의 swelling 메커니즘은 주로 free water의 빠른 수분 흡수를 이끄는 모세관력이다. 이 SPHs은 약물전달시스템이나 조직공학에 적용된다. pH 민감성 HECHA 하이드로젤의 swelling 거동은 pH 1~13까지 조절하여 확인하였다(도 6). HECHA 하이드로젤의
swelling 비율은 최소 1118.05%부터 최대 3154.12%까지 변화가 관찰되었다. pH관점에서 비교할 때, pH 증가에 따라 swelling 비율이 상당히 증가하였다. 이 결과는 HA에 카복실기(carboxyl group)가 존재하기 때문이다. HEC는 pH에 작용기인 카복실기를 가지지 않으므로 HECHA10 하이드로젤은 pH 용액에 민감하지 않다. 그러므로 HECHA10 하이드로젤은 다른 pH 용액에서도 유사한 swelling 비율, pH=1에서 1108.05%, pH=13에서 1263.99%으로 나타났다. 하지만 카복실기를 갖는 다른 하이드로젤(HECHA31, 11, 13, 01)은 pH에 민감한 특성을 보여주었다. pH 증가에 따라 HA의 카복실기는 carboxylate(-COO-)로 이온화될 수 있다. Carboxylate의 음전하는 정전기적 반발력을 일으키고, 이는 하이드로젤 네트워크 내에 기공 사이즈를 증가시킨다. 또한 이온화된 작용기가 수화막을 형성함으로써,
swelling 비율이 증가하게 된다. 또한 HECHA 하이드로젤이 더 많은 HA농도를 가질수록 HECHA 하이드로젤의 swelling 비율은 증가하는 것을 보여주었다(pH=1을 제외). 이는 HA는 HEC보다 우수한 수분 결합력을 가지기 때문이다. 게다가, pH에 따른 swelling 비율의 증가가 점진적으로 평행이 되는데, 이것은 작용기가 완전히 이온화 되거나 이온화된 작용기가 수화막 또는 다른 이온들에 의한 가리움 효과를 가지게 되기 때문이다. 이러한 결과와 같이, 많은 pH 민감성 하이드로젤은 사용하는 고분자의 carboxylic, sulfonic acid group 그리고 1차, 2차, 3차 amine group과 같은 작용기 의한 결과이다. 이러한 pH에 민감한 하이드로젤은 제한된 조건 하에서 원하는 pH에서 약물을 방출하도록 설계될 수 있다. HEC -HA 복합 하이드로젤의 유변학적 및 기계적인 성질 분석 유변학적 성질은 하이드로젤의 점탄성 거동과 이들의 피부 전달 시스템으로서의 응용가능성을 살펴보기 위해서 Oscillatory test를 통해서 실시하였다. 저장(또는 탄력) 탄성율(G’)은 탄성이나 스트레스에 대해 저장된 에너지로 정의할 수 있고, 손실 탄성율(G”)은 점도나 스트레스에 대한 에너지 손실을 의미한다. 이러한 인수들은 하기 [수학식 3]에 의해 계산된다. [수학식 3] G′ = G* cosδ, G” = G* sinδ 여기서 G*은 G’과 G”의 합, G*= , δ은 위상각을 의미한다. 또한 감쇄율은 저장 그리고 손실 탄성률의 비율(tanδ=G”/G’)을 나타낸다. HECHA 하이드로젤의 유변학적 특성 스펙트럼은 0.1에서 10 rad/s 각 진동수
범위의 함수로 나타내었다(도 7). HECHA10은 실험 조건에서 부서지게 되어 유변학적 특성을 연구하지 못하였다. 모든 스펙트럼에서 HECHA 하이드로젤의 저장 탄성률 G’값은 어느 각 진동수에서도 항상 손실 탄성률 G”값보다 높게 나타났다. 이러한 결과는 모든 샘플의 형태학적 특성은 하이드로젤과 같은 거동을 보여준다는 것을 나타낸다. 또한 각 진동수가 증가할 때, 저장 탄성률 G’가 증가하였다. 이는 HECHA 하이드로젤이 실험조건 내의 기계적인 힘에 의해 3차원 네트워크 구조가 붕괴되지 않고 안정한 구조를 이룬다는 것을 알 수 있었다. 게다가 HECHA 하이드로젤의 저장 탄성률 G’은 HEC 질량비 증가에 따라 일정한 증가폭을 보였다. 이는 HEC 고분자 사슬이 HECHA 하이드로젤의 강도를 강화시키는데 기여한다는 것을 나타내었다. 기계적 성질 분석 HECHA 하이드로젤의 기계적 특성은 식품과 약학 분야에서 사용되는 질감 분석(texture analysis)에 의해 측정되었다. 최적의 피부전달 시스템을 구현하기 위해 베지클의 단단함, 응집성, 점착성은 중요한 요인이며, 이러한 요소들의 적절한 균형을 유지하는 것은 중요하다. 이러한 기계적 특성의 결과는 표 2에 나타내었다. 단단함은 초기 압축과정에서 주어진 변형이나 최대 peak 값을 위해 요구되는 힘으로 정의된다. 단단함은 동일한 고분자 농도에서 HEC의 질량비에 의존적이었다. HEC 질량비가 증가함에 따라 HECHA 하이드로젤의 단단함은 6배 증가하였다(HECHA10: 367.52g, HECHA01: 59.25g). 이 결과는 HECHA01보다 HECHA10이 더 높은 물리적 강도를 보였던 SEM 이미지 또는 유변학적 실험결과와 일치하는 결과이다. 응집성은 처음 그리고 두 번째 압축에서 샘플의 모양을 유지하기 위한 힘 또는 양의 값의 비율로 정의된다. HECHA11 하이드로젤은 가장 높은 응집성(1.024 g*s)을 가졌다. 반면 HEC 또는 HA 비율의 증가는 응집성을 감소시켰다. 특히 HECHA10은 가장 높은 단단함과 가장 낮은 응집성을 보였는데, 이는 쉽게 부서져 약물전달시스템으로써 적절하지 못하다. 점착성은 초기압축 이후 probe로부터 샘플이 떨어지기 위한 힘 또는 음의 값의 영역으로 정의된다. 또한 점착성은 피부가 매우 동적인 움직임을 가졌으므로 피부전달 시스템에서 중요한 역할을 한다. HECHA13은 가장 높은 점착성(-91.58g*s)을 보였다. HEC와 HA의 적절한 혼합은 하이드로젤의 점착성을 증대시키고 이는 특정한 피부 부위에서의 보유시간을 더 연장시킬 수 있다. 이러한 물리화학적인 결과들을 통해 본 발명에서는 HECHA13이 적절한 피부 전달 시스템으로 선택되었다.
약물 포집 및 방출 효율 최적의 피부전달 시스템으로 선택된 HECHA13의 약물(Isoliquiritigenin:ILTG) 포집 효율을 평가하였다. 이전 연구에서 ILTG은 여드름균에 glycyrrhizin, liquiritin, liquiritigenin과 같은 다른 감초 성분들에 비해 가장 낮은 최소 저해농도(MIC50)을 가지며, 가장 큰 clear zone을 형성하였다. ILTG은 소수성 물질의 용해도를 향상시키기 위해 화장품 성분으로써 사용되는 20% 1,3-BG 용액에 용해하였다. 그 결과, HECHA13의 ILTG 포집효율은 46.98%으로 나타났다. ILTG의 방출 효율은 다양한 pH 용액에서 실시하였다. 많은 연구들이 하이드로젤로부터의 약물 방출 메커니즘을 설명하고 있다. 예를 들어 확산 조절, swelling 조절 그리고 화학적 조절이 있다. 하지만 약물의 포집과 방출은 여러 가지 요인에 의해 발생된다. 확산조절에 의한 방출은 일반적으로 Fick의 제1법칙에 의한 것으로 이 메커니즘은 기공 사이즈, 가교정도, 하이드로젤의 고분자 구조에 의존한다. Swelling 조절 메커니즘은 하이드로젤의 팽창보다 포집된 약물이 하이드로젤로부터 더 빠르게 확산되는 것이다. 화학적 조절 메커니즘은 고분자의 작용기와 pH, 용매 성분, 이온강도 등의 외부요인 사이의 화학적 반응과 관련되어 있다. pH민감성 하이드로젤은 pH에 의존하여 swelling 그리고 de-swelling되는 특성을 가지며, 따라서 특정 pH에서 원하는 치료상의 특성을 위해 이상적인 시스템으로 사용된다. pH에 따른 약물 방출 효율을 도 8에 나타내었다. pH가 7까지 증가할 때, ILTG 방출 효율은 41.63% (pH=1)에서 71.53%(pH=7)(pH 3 = 55.37%, pH 5 = 64.62%)까지 점진적으로 증가하였다. 이 방출 효율의 증가는 swelling 비율과 비교하여 유사한 경향을 나타낸다. pH가 증가 함에 따라 정전기적 반발력에 의해 하이드로젤의 기공사이즈 증가한다. 그럼으로 많은
양의 약물이 하이드로젤 매트릭스로부터 쉽게 확산된다. 하지만 pH 7 이상에서 swelling 비율은 증가하지만(도 6), 약물 방출 효율은 감소하였다(pH 9 = 67.06%, pH 11 = 57.18%, pH 13 = 40.66%). 이러한 이유는 ILTG이 염기성 조건에서 파괴되거나 변형되기 때문이다. ILTG의 정량적 분석을 위한 HPLC 측정에서도 pH 9 이상에서 피크 세기가 감소하거나 피크 갈라짐 현상을 볼 수 있었다. 많은 연구들이 phenolic 분자의 변형을 이끄는 다양한 pH 용액에서 phenolic 성분들의 안정도를 조사하였다. 이러한 pH 민감한 특성은 피부전달 시스템에서 약물전달을 위해 중요한 요인이다. 피부 표면(각질층)의 pH는 상대적으로 산성의 범위 5.0 에서 6.0으로 산성막이라고 불리며, 표피 세포, 분비선(피지선, 아포크린선, 외분비선), 나이 그리고 성별과 같은 내, 외부적 요인에 의해 결정된다. 적절한 각질층의 pH는 피부장벽기능과
세포간지질의 구조, 각질층 항상성 유지와 같은 생리적인 과정들을 향상시키는데 중요한 역할을 한다. 각질층의 세포간지질은 산성 조건에서 이중층의 lamellar 구조를 가지며 안정한 상태이지만, pH 불균형이 야기되어 pH 6.0 이상, 4.5 이하 조건에서는 micelle (pH > 6.0)구조를 보이거나 불규칙적 구조(pH<4.5)로 세포간지질의 구조가 변형된다. 이러한 pH 불균형은 (산성막의 붕괴) 염증, 여드름, 자극성 접촉성 피부염을 초래하며, 각질층의 점착과 투과성 장벽을 감소시킨다. 항균활성 ILTG를 포집한 HEAHA13의 항균활성을 확인하기 위해, pH 불균형으로 야기되는 P. acnes로 실험을 진행하였다. 여드름 병변은 다음 4개의 과정으로 설명될 수 있다 (1) 염증 매개체 (예, CD4+ 림프구) (2) 각질화 과정 변형 (3) 안드로겐에 의한 피지생성의 증가 (피지는 염증성 매게인자인 IL-1 분비를 유도한다) (4) P. acnes의 모낭 군집 형성. 많은 연구들이 피지 생성의 감소, 여드름 균의 과다증식 감소, 정상적인 각질화, microcomedonse와 같은 관점에서 일반적인 항생물질(예: Benzoyl peroxide, Tretinoin)에 의한 여드름 치료를 보고하고 있다. 이러한 메커니즘 중 여드름 치료를 위해 P. acnes의 군집화를 감소 시키는 연구가 주로 진행되고 있다.사전 연구에서 본 발명자들은 ILTG이 P. acnes의 군집화를 감소시킨다는 것을 확인하였다. 각질층의 pH는 여드름 생성 및 피부 생리학적 성질을 결정하는 중요한 인자로서, pH는 P. acnes의 성장 속도, 외 효소와 병원균의 생성속도, 외 효소의 안정화와 효소 활성에 영향을 미친다. 다양한 pH 5.5 ~ 8.5 범위에서 P. acnes를 배양할 때, P. acnes의 성장 속도는 다르게 나타났다. P. acnes는 pH 5.5에서 성장하지 않았으며,반면 pH 6.0 ~ 7.0에서는 잘 성장하였다. ILTG을 포집한 HECHA13의 항균활성결과는 도 10에 나타내었다. ILTG을 방출시키기 위해 HECHA13은 다양한 pH의 배지에 우선 배양시켰다. 대조군(Blank)은 ILTG를 포집한 HECHA13을 처리하지 않는 군으로써, 오로지 pH에 따른 여드름균의 성장을 나타낸 것이다. 실험군은 ILTG이 포집된 HECHA13이 우선 배양되었다. Blank군에서 P. acnes의 colony 수와 크기는 pH 상태에서 다르게 나타났다. Colony 크기는 달랐지만, pH 7에서 가장 많은 colony가 형성되었고, 그 수는 pH 8> pH 9 > pH 6 순서로 나타났다. 이러한 경향은 pH가 P. acnes의 성장 속도와 활성에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 이를 통해 산성막이 붕괴되었을 때, 특히 pH 7 에서, 여드름의 성장을 야기시킬 수 있음을 추측할 수 있다. 실험군에서는 P. acnes의 colony 수가 모든
pH에서 blank군에 비해 감소하였다. 실험군 중에서 pH 7 조건이 가장 큰 저해 효과를 가지는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 약물의 방출 효율 연구와 일치하는 것으로서 pH 7에서 ILTG이 많은 양 방출되었기 때문에 뛰어난 항균 활성을 가지게 됨을 보여준다. 따라서, HECHA13은 여드름 병변 치료를 위한 피부전달 시스템으로 적용될 수 있었다. 공초점 레이저 현미경( CLSM )을 이용한 In vitro 피부 투과도 분석 HECHA 하이드로젤의 피부전달시스템으로써 능력을 조사하기 위해 공초점 레이저 현미경(confocal laser scanning microscope, CLSM) 이미지를 통해 피부층에 따른 투과정도를 시각화하였다. 활성 성분의 피부투과 경로는 세포 사이, 세포 내 그리고 모공으로 분류된다. 이러한 경로 중 모공을 통한 경로는 가장 많은 활성 성분을 투과시킬 수 있다. 형광을 위해 ILTG 대신에 Nile red로 대체하였으며, 형광 세기는 ILTG의 피부 투과 정도를 간접적으로 보여주는 지표이다. Differential interference contrast(DIC) 모드는 표피, 진피 그리고 모공으로 구성되는 피부 층을 보여준다. CLSM 이미지는 도 11에 나타내었다. 0.02% Nile red를 포함하는 1,3-BG 용액을 처리하였을 때, 형광은 오직 표피의 위층에서만 관찰되었고, 표피 하층부 및 진피층까지 투과되지 않았다. 게다가 형광은 모공주변에서 관찰되지 않았다. 반면, HECHA13 처리군은 전체 표피에서 높은 형광 광도를 나타냈으며, 표피층에서 진피층으로 갈수록 그 강도는 감소하였지만, 진피층에도 고르게 분포되었다. 이 결과로 HECHA13에 의해 swelling된 각질층이 일시적으로 피부 장벽을 방해하게 되고, 이에 의해 하이드로젤에 포집된 활성 성분이 쉽게 피부에
투과될 수 있게 될 것임을 예측할 수 있었다. 게다가 가장 높은 형광 강도가 모공에서 관찰되었다. 이는 많은 활성 성분들이 모공의 경로로 투과될 수 있음을 나타내는 것이다. 모공은 피부에서 여드름을 유발시키는 피지선으로 둘러싸여 있으며, 여드름균이 생장하기 때문에 ILTG을 포집한 HECHA13은 효과적으로 여드름을 제어할 수 있을 것으로 예상할 수 있었다. 항균활성이 있는 성분의 피부전달 시스템을 개발하기 위해, 본 발명에서는 HEC와 HA를 이용하여 pH에 민감성 하이드로젤을 제조하였다. 피부 표면의 산성막의 파괴는 여러 가지 피부 질환을 야기하며 그 중에서도 특히 여드름에 유발한다. 이러한 피부 병변을 치료하기 위해서 여드름균에 대한 항균활성을 가지는 ILTG을 활성 물질로 담지하였다. 하이드로젤의 합성은 FT-IR 스펙트럼 1287 cm-1(DVS의 S-C 신축진동), 1325 cm-1 그리고 1138 cm-1(S=O 신축진동)에서의 새로운 피크발견을 통해서 하이드로젤의 합성을 확인하였다. HECHA 하이드로젤의 SEM 이미지는 3차원 네트워크 구조(기공 사이즈 50~90μm)를 확인할 수 있었으며, HEC의 첨가는 균일한 기공 구조를 형성함을 보여주었다. 하이드로젤의 수분결합력은 열 중량 분석에 의해 평가되었다. 하이드로젤 사이에 수분결합력 차이는 100℃에서 최대 30%까지 나타났다(HECHA10에 의한 최대 수분 손실: -64.59%, HECHA01에 의한 최소 수분 손실: -31.35%). HECHA 하이드로젤의 swelling 비율(%)은 HECHA10을 제외하고, pH 증가에 따라 증가하였다. 특히 가장 높은 HA 비율을 가지는 HECHA01은 가장 큰 수분 흡수를 보였다. 이러한 경향은 정전기적 반발력, 수화막 형성 및 HA에 의해 야기되는 것이다. HECHA 하이드로젤이 겔과 같은 거동을 보인다는 것을 유변학적 결과를 통해 확인하였다. 이러한 물리화학적인 특성을 통해 HECHA13이 최적의 피부전달 시스템으로 선정하였다. HECHA13의 ILTG 포집 효율은 46.98%로 나타났다. ILTG의 방출 효율은 기공 사이즈 증가에 따라 pH 7까지 증가하여 70%로 나타났고, 반면 pH 7 이상에서는 ILTG 파괴와 변형으로 인해 방출 효율이 감소하였다. P. acnes에 대한 항균 활성은 pH에 따라 실시하였으며, P. acnes의 colony 형성은 pH 7에서 가장 활발하였다. 하지만 ILTG을 포집한 HECHA13을 처리하였을 때, pH 7에서 colony 수가 크게 감소하였다. 이러한 결과는 방출 효율 결과와 일치한다. CLSM 이미지는 하이드로젤이 일시적으로 피부 장벽을 방해함으로써 피부를 swelling 시킴으로써 HECHA13이 쉽게 활성성분을 투과시킨다는 것을 보여준다. 또한 하이드로젤은 피지선에 둘러 쌓인 모공을 통해 대부분의 약물을 투과시킴으로써 P. acnes 성장을 효과적으로 저해 할 수 있을 것으로 예상할 수 있다. 본 발명의 HECHA 하이드로젤은 smart 하이드로젤로서, 항균성 치료와 pH의 불균형으로 인해 야기되는 다른 피부 질병을 위한 피부전달 시스템으로 효과적으로 이용될 수 있음을 상기의 실험 결과들로부터 확인할 수 있었다. Claims (13)
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