Alumina n을 이용할 경우 추출용매는 어떤 것을 사용하나

본 발명은 백합나무 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 더 상세하게는 본 발명은 목련과 식물인 백합나무(Liriodendron tulipifera)로부터 추출한 유효성분을 이용하여 만든 백합나무 추출물을 함유하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

백합나무(Liriodendron tulipifera)는 북아메리카 원산의 목련과 식물로서, 높이는 약 13m이며 나무껍질은 잿빛과 검은빛이 섞인 갈색이다. 잎은 어긋나고 넓고 둥근 달걀 모양이며 길이와 나비는 6∼18cm 정도이다. 꽃은 5∼6월에 녹색을 띤 노란색으로 피고 가지 끝에 지름 약 6cm의 튤립 같은 꽃이 1개씩 달린다. 꽃받침조각은 3개, 꽃잎은 6개이다. 꽃잎 밑동에는 주황색의 무늬가 있다. 암술과 수술이 많고 꽃이 진 다음 꽃턱이 길이 7cm 정도 자란다. 열매는 폐과로서 10∼11월에 익으며, 날개가 있고 종자가 1∼2개씩 들어 있다. 미국에서는 생장이 빠르므로 중요한 용재수(用材樹)로 쓰나 한국의 중부 이남에서는 관상용으로 심는다.

본 명세서에서, 화장료 조성물의 유효성분으로 사용되는 백합나무 추출물은, 백합나무의 다양한 부위(예컨대, 백합나무의 줄기, 가지, 뿌리, 잎, 꽃 및 종자 등)로부터 얻은 추출물을 의미하며, 바람직하게는 백합나무의 가지로부터 추출한 추출물을 의미한다.

본 발명의 백합나무 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여(예컨대, 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 또는 1,3 부틸렌 글리콜을 가하여) 제조될 수 있다.

바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 백합나무 추출물의 제조 방법은 다음과 같다. 먼저 백합나무 가지를 정제수로 세척한 후 건조하고 작은 조각으로 파쇄 한 뒤, 여기에 건조 중량의 1∼10배의 물, 탄소수 1∼4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 또는 1,3-부틸렌 글리콜 등을 가한다. 그 후 냉각 콘덴서가 장치되어 유효성분이 증발되는 것을 방지한 상태에서 40∼100℃에서 3∼20시간 가열하여 추출하거나, 4∼40℃에서 1∼15일간 추출하고 회전 감압 증발기로 완전히 건조시켜 제조한다. 이때 1,3-부틸렌 글리콜의 경우에는 회전 감압 증발기를 이용하여 건조시키기 어려우므로 직접 위의 조건에서 추출한 후 건조 감량이 1%(w/v)되게 조정하여 본 발명의 화장료에 이용한다.

한편, 본 발명의 백합나무 추출물은 상술한 추출법에 의한 추출물뿐만 아니라, 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법 또는 초음파 추출법에 의한 추출물도 포함한다.

상기 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출법은 초임계 유체 추출법(supercritical fluid extraction)을 의미하는 것으로, 일반적으로 초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며, 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있으며 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다(J. Chromatogr. A. 1998;479:200-205).

이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나온다.

지용성 물질을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 시료에 다시 소량의 공용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있다.

본 발명의 초임계추출법에 사용되는 초임계 유체는 초임계 이산화탄소 또는 이산화탄소에 추가적으로 공용매를 혼합한 혼합유체를 사용함으로써 효과적으로 유효 성분을 추출할 수 있다. 이러한 공용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.

추출된 시료는 대부분 이산화탄소를 함유하고 있는데 이산화탄소는 실온에서 공기 중으로 휘발되므로 상기 방법으로 얻은 추출물을 화장료 조성물로서 사용할 수 있으며, 공용매는 감압증발기로 제거할 수 있다.

초음파 추출법에 사용할 수 있는 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.

추출된 시료는 진공 여과하여 여과액을 회수한 후 감압증발기로 제거하고, 동결 건조하는 통상의 추출물 제조방법을 통해 추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 백합나무 추출물은 통상적인 정제 과정 및/또는 발효 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 백합나무 추출물에 포함된다고 해석된다. 또한, 효모균, 유산균, 바실러스속 균 및 이의 혼합물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 균으로 20 내지 40 ℃의 온도 조건 하에서 pH 5 내지 7을 유지하면서, 1 내지 7일간 발효시켜 얻어지는 발효물도 본 발명의 백합나무 추출물에 포함된다고 해석된다.

또한, 본 발명의 백합나무 추출물은 포제법을 이용하여 얻어낸 추출물도 포함한다. 포제란 한방이론에 근거하여 약재를 가공 처리함으로써 약재 본래의 성질을 변화시키는 제약 기술이다. 주로 찌거나, 삶거나, 불에 볶거나, 불에 굽거나 달구는 공정 또는 이들이 혼합된 공정의 방법을 말한다. 처리 조건은 삶는 경우 60-100℃, 30분 내지 6시간이고, 찌는 경우 120∼180℃, 10분∼2시간이고, 굽는 경우 80-100℃, 10분 내지 2시간에서 용이하게 선정한다. 본 발명에서는 백합나무를 쪄서 건조시킨 후 사용하였으며 이를 이용하여 추출물을 제조하였다. 백합나무를 쪄서 건조시키는 포제법을 이용하여 추출한 후 용매 추출법 뿐만 아니라, 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법 또는 초음파 추출법에 의한 추출 방법으로 추출할 수 있으며, 본 발명의 실시예에는 70% 에탄올을 이용하여 추출하여 실험에 사용하였다.

본 발명의 백합나무 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 백합나무 추출물은 항산화 효과(실험예 1), 세포재생 효과(실험예 2), 세포자극완화 효과(실험예 3), 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과(실험예 4), 항염 효과(실험예 5), MMP-1 생성 억제 효과(실험예 6) 및 콜라겐 합성 증진 효과(실험예 7)가 탁월하다.

본 명세서에서, 용어 "피부 상태 개선"은 다양한 피부 상태의 개선을 의미하는 것으로, 이러한 피부 상태 개선은 예를 들어, 피부 노화방지, 피부 주름개선, 피부 보습 등의 직접적인 피부 상태 개선뿐만 아니라, 항산화, 항염, 자외선에 의한 피부손상억제, 세포재생 및 피지분비 억제 등과 같이 피부 알러지 및 피부 염증 반응을 억제 또는 개선하거나, 콜라겐 분해 효소 억제 및 콜라겐 합성 증진 등과 같이 피부 노화를 방지하는 2차적인 피부 상태 개선도 모두 포함한다. 또한, 두피도 피부에 해당됨에 따라, 두피의 보습, 항산화, 항염, 세포재생, 피지분비 억제 효과도 피부 상태 개선에 포함된다. 따라서, 본 발명의 피부 상태 개선용 화장료라 함은, 피부 주름개선용, 항산화용, 피부 세포 재생용, 항염용, 자외선에 의한 피부손상억제용, 피부 노화방지용, 피지 분비억제용 및 피부 보습용, 화장료를 일컫는 것이다.

이러한 본 발명의 백합나무 추출물은 화장료 조성물로 제조될 때도 상기와 같은 피부 상태 개선 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 백합나무 추출물의 함량은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.00001∼30.0중량%, 바람직하게는 0.0001∼20.0중량%이다. 이때 백합나무 추출물의 총 중량이 0.00001중량% 미만일 때에는 그 효과가 나타나기 어렵고, 30.0중량%를 초과할 때에는, 피부에 자극을 유발할 가능성이 높으며 제형의 안정화에도 큰 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 백합나무 추출물 이외에 생체성분의 활성을 유지시켜주는 다양한 성분들, 예컨대 보존제, 삼투제, pH 조절제, 완충제, 안정제, 수산화알루미늄, 인산 알루미늄, 계면활성제, 리포솜, 증점제 등 및 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 유연 화장수(스킨), 수렴 화장수, 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩 등의 기초 화장료의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 백합나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료를 제조하였으며, 이러한 본 발명의 화장료는 피부 주름 개선 효과(실험예 8), 피부 탄력 개선 효과(실험예 9), 피지 분비 억제 효과(실험예 10) 및 피부 보습력 개선 효과(실험예 11)가 탁월할 뿐만 아니라, 유효성분으로 포함된 백합나무 추출물에 의하여 항산화 효과(실험예 1), 세포 재생 효과(실험예 2), 세포 자극 완화 효과(실험예 3), 광노화 방지효과(실험예 4), 항염 효과(실험예 5), 및 MMP-1 생성 억제(실험예 6)와 콜라겐 합성 증진(실험예 7)에 의한 피부 노화 방지효과를 기대할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 유효성분을 함유하는 화장료 조성물을 사람의 피부에 도포하는 것을 특징으로 하는 화장 방법을 제공한다.

본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 사람의 피부에 도포하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 피부에 도포하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다.

본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 피부 보호 효과가 우수한 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 또는 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 또는 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 또는 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 화장료를 사람의 피부에 직접 도포하는 화장 방법을 수행하면, 탁월한 피부 주름 개선 효과; 항산화 효과; 세포 재생 효과; 피부 세포 자극 완화 효과; 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과; 항염 효과; 피부 탄력 개선; 콜라겐 분해 효소 억제, 콜라겐 합성 증진 및 에 의한 피부 노화 방지 효과; 피지 피부 보습 효과; 및 피부 보습 효과를 달성할 수 있다.

< 실시예 >

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 백합나무 추출물 제조 I

건조된 백합나무 가지 200 g에 물 및 에탄올의 비율을 7:3으로 조정한 70% 에탄올 1000 ㎖를 가하여 실온에서 3일 동안 침출하였다. 이를 여과하고 여액을 진공 농축하여 건조 추출물을 얻었으며, 추출 수율은 44.8g/200g이었다. 상기 건조 추출물을 1% (w/v) 농도가 되도록 50% 1,3-부틸렌 글리콜 용액으로 용해하고 여과한 후 본 발명의 실험에 적용하였다.

실시예 2-16. 백합나무 추출물의 제조 II

실시예 2 내지 실시예 16은 하기 표 1의 추출용매를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 같은 방법으로 추출하여 백합나무 추출물을 얻었다. 또한, 실시예 15, 실시예 16은 통상적인 초임계 추출법, 초음파 및 통상적인 방법을 이용한 추출을 통해 백합나무 추출물을 얻었다. 단, 실시예 15의 경우에는 공용매로 올리브유를 사용하였으며 액상이다.

백합나무 추출물의 추출 수율

실시예 17. 백합나무 발효 추출물의 제조

정제수로 세척하고 건조시킨 백합나무 가지를 분말화한 후 300메시를 이용하여 미세하게 만들었다. 이것을 10g/L되게 효모 배양액(Potato Dextrose Broth, 아큐메디아, 미합중국)에 첨가하였다. 발효에 사용한 효모 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)를 사용하였으며, 배양액 당 50,000 cfu/L로 첨가하였다. 배양은 5L 발효조를 이용하여 7일간, 30℃, pH 5∼7로 유지하며 배양하였다. 배양이 완료된 백합나무 발효액을 원심분리하여 배양균을 1차 제거 한 후 0.25μM 여과지를 이용하여 최종여과 하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 4℃의 저온 창고에서 약 10일간 숙성시킨 후 이 여과 숙성액을 다시 0.25μM의 여과기를 이용하여 여과하여 본 발명에 사용하였으며, 편의상 이 발효 여과액을 백합나무 발효 추출물이라 칭하였다. 또한, 이 방법에 의한 추출 수율은 402.8g/1kg이었다. 이하 실험에 사용된 백합나무 발효 추출물은 최종농도가 1g/100mL가 되게 유지하여 사용하였다.

실시예 18. 포제법에 의한 백합나무의 추출물의 제조

백합나무의 포제법 추출물을 얻기 위해 본 발명의 실시예에서는 쪄서 건조시키는 공정으로 처리하였다. 즉, 정제수로 세척하고 건조시킨 백합나무 가지를 분말화한 후 300메시를 이용하여 미세하게 만든 후, 찌기는 온도 60℃~150℃, 10분∼2시간 조건으로 실시한 후 음건하였다. 이렇게 하여 만든 백합나무의 포제법 추출물은 추가로 70% 에탄올을 이용하여 추출하였으며, 그 결과 46.8g/1kg의 추출물을 얻었다.

실험예 1. 백합나무 추출물의 항산화 효과

본 실험은 상기 실시예 1, 15, 16, 17, 18에서 수득한 백합나무 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 비타민 C를 양성 대조군으로 하여, NBT법으로 항산화 효과(활성 산소 소거율)를 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성 산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검 물질(백합나무 추출물, 비타민 C)이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거율(%)을 평가하였다. 한다. 활성 산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560 nm에서 측정하는 것으로 활성 산소 소거율(%)을 측정한다.

측정방법으로서

1. 0.05M Na2CO3 ------------------------------------ 2.4ml

2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1ml

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1ml

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1ml

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1ml

6. 크산틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1ml

7. 6mM CuCl2 용액----------------------------------- 0.1ml

① 바이알병에 1,2,3,4,5를 각각 가하고 여기에 시료 용액 0.1ml를 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.

② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.

③ 그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

④ 시료 용액의 블랭크(Blank)는 상기 6 대신 정제수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 So를 측정한다.

⑤ 공시험은 상기 시료 용액 대신 정제수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bt를 측정한다.

⑥ 공시험의 블랭크(Blank)는 상기 시료 용액 및 6 대신 정제수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

활성 산소 소거율(%)은 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 2와 같다.

St : 시료 용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험 용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료 용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험 용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

백합나무 추출물의 항산화 효과

상기 표 2의 활성 산소 소거율 실험 결과에서도 알 수 있듯이, 다양한 추출방법을 통해 얻은 본 발명의 백합나무 추출물은 어떤 방법에 의하든지, 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 비타민 C(1 중량 %)와 유사하거나 훨씬 우수한 항산화 효과를 갖고 있음을 알 수 있었다.

실험예 2. 백합나무 추출물의 세포재생 효과

24 웰 플레이트에 HaCaT 케라티노사이트(German Cancer Research Institute, Germany)를 2× 105 cells/well의 밀도로 10% FBS가 첨가된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium, Gibco)으로 접종하여 가습화 된 37℃, 5% CO2 배양기에서 1일 배양하였다. 무혈청(Serum-free) DMEM으로 교환 후 백합나무 추출물들의 시료를 1.0%(v/v) 되게 처리하여 3일 배양하였다. 이때, 대조군(음성)으로는 백합나무 추출물 대신 식염수를 사용하여 실시하였다. 배양 후 세포생성 효과를 보기 위해 MTT assay법을 이용하여 세포의 생성 정도를 비교 평가하였으며, 양성 대조군으로 TGF-β 10ng/mL을 적용하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

백합나무 추출물의 세포 재생(Cell Proliferation) 효과

상기 표 2의 세포 활성율 실험 결과에서도 알 수 있듯이, 다양한 추출방법을 통해 얻은 본 발명의 백합나무 추출물은 어떤 방법에 의하든지 우수한 세포 재생 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 3. 백합나무 추출물의 세포자극완화 효과

인간 피부 세포인 섬유아세포(한국 세포주 은행, 대한민국)를 T-75 플라스크(Falcon, 미합중국)에서 80% 정도 성장할 때까지 배양하였다. 이것을 다시 96-웰 플레이트(Falcon, 미합중국)에 3× 104 cells/well이 되게 옮겨 24시간 배양하였다. 배양 후 현미경을 통해 세포가 완전히 부착되어 잘 자라는지 여부를 확인하고 피부세포 자극원으로 락트산을 이용하여 실험을 진행하였다. 이때 락트산은 2.0%를 사용하였다. 즉, 96웰의 각각에 2.0 % 락트산이 함유된 DMEM(시그마, 미합중국) 배지를 200㎕씩 첨가하고 실시예 1, 15, 16, 17, 18의 백합나무 추출물 또는 발효액을 1.0 %(v/v)로 조절하여 첨가하였다. 이때 락트산 및 백합나무 추출물을 모두 첨가하지 않은 것을 대조군(음성)으로 하였고, 락트산만 첨가한 것을 비교군으로 하였다. 시험물질을 첨가하고 12시간 경과 후 세포의 생존율을 비교하기 위하여 MTT(시그마, 미합중국) 솔루션(3mg/ml)을 첨가하여 세포 생존율을 ELISA READER(Molecular Devices, 미합중국)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하고 하기 수학식 2에 따라 세포 생존율(%)을 계산하였으며 실험 결과는 하기 표 4에 기재하였다.

백합나무 추출물의 세포자극완화 효과

상기 표 4의 결과에서도 알 수 있듯이, 다양한 추출방법을 통해 얻은 본 발명의 백합나무 추출물은 어떤 추출 방법에 의하든지 락트산 처리에 의한 세포 독성을 완화해주어 세포 생존율을 크게 증가시켰으며, 추출방법의 차이에 따른 추출물의 세포자극 완화 효과는 큰 차이가 없이 뛰어남을 알 수 있었다.

실험예 4. 백합나무 추출물의 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화 효과

본 실험은 상기 실시예 1, 15, 16, 17, 18에서 수득한 백합나무 추출물의 자외선 조사에 의한 세포 독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 실시되었다. 간단하게 설명하자면, 섬유아세포 (fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5 X 104 개씩 넣고 24 시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 1000 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B (UVB) 램프 (Model : F15T8, UV B15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포 배양 배지 (DMEM에 10 % FBS가 첨가된 것) 1 ㎖을 첨가하였다. 여기에 백합나무 추출물을 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다. 이때 실험에 사용된 백합나무 추출물은 각각 1.0%의 농도로 사용되었다. 24 시간이 지난 후 배지를 제거하고, 각 웰당 세포 배양 배지 500㎕와 MTT 용액 (2.5 ㎎/㎖) 60 ㎕를 넣은 후 2 시간 동안 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl (0.04N)을 500 ㎕씩 넣어주었다. 5 분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100 ㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 570 nm 흡광도를 측정하였다. 이때 양성 대조군으로 TGF-β(10ng/ml)를 사용하였고, 음성 대조군으로는 백합나무 추출물 대신 식염수를 사용하였다. 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화율(%)은 하기 수학식 3에 의해 계산하였고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

백합나무 추출물의 자외선 조사에 의한 세포 보호 효과

상기 표 5의 세포 독성 완화율 결과에 따르면, 다양한 추출방법을 통해 얻은 본 발명의 백합나무 추출물은 어떤 방법에 의하든지 우수한 세포 독성 완화 효과를 가지는 것을 알 수 있었다. 또한 각각의 세포 생존율은 우수한 세포 독성 완화 효과가 있는 것으로 잘 알려진 TGF-β의 값에 근접한 정도의 세포 생존율을 가져, 본원발명의 백합나무 추출물이 자외선 조사에 의한 세포손상을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

실험예 5. 백합나무 추출물의 염증성 사이토카인 발현 억제 효과

본 실험은 상기 실시예 1, 15, 16, 17, 18에서 수득한 백합나무 추출물에 대하여, 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 평가하기 위한 것으로서, 사람의 표피 조직에서 분리한 섬유아세포 (Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5 × 104개의 세포를 넣은 다음 24 시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B (UVB) 램프 (Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지 (DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350 ㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 백합나무 추출물을 1.0%(w/v) 씩 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 백합나무 추출물의, 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소 면역 분석법 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, 양성대조군으로 IL-1α억제물질로 알려진 케토프로펜(Ketoprofen)을 사용하였다. 염증성 사이토카인 (IL-1α)의 발현 억제율(%)은 하기 수학식 4에 의해 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량

백합나무 추출물의 항염 효과

상기 표 6의 결과에 따르면, 다양한 추출방법을 통해 얻은 본 발명의 백합나무 추출물은, 어떤 추출 방법에 의하든지, 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 억제하는 것을 알 수 있었다. 특히, 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성 억제 효과가 있는 것으로 알려진 양성 대조군인 케토프로펜과 비교하여, 케토프로펜의 농도(100㎍/㎖) 차이를 감안하더라도, 상기와 같은 우수한 억제율을 나타낸 것은 본원 발명의 백합나무 추출물이 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서도 효과적으로 방어함을 알 수 있다.

실험예 6. 백합나무 추출물의 MMP-1 생성 억제 효과

상기 실시예에서 얻은 시료를 이용하여 본 실험을 실시하였다. 각 시료는 50% 1,3-부틸렌 글리콜 용액에 건조 중량이 1%(w/v)되게 녹여서 본 실험에 이용하였다. 실험은 다음과 같이 진행되었다. 먼저, 인체 정상 섬유아세포를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc, 덴마크)의 각 웰에 1× 105 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국)에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어, 백합나무 추출물의 최종 농도를 1.0%로 하여 무혈청 DMEM 배지로 교체한 실험과, 백합나무 추출물이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지로 교체한 대조군을 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양을 측정한 뒤, MMP-1의 양은 ng/㎖ 환산하였다. 양성 대조군으로 TGF-β(10ng/ml, Roche, 미합중국)을 사용하였으며, MMP-1 생성 억제율은 하기 수학식 5에 따라 구하였다. 그 결과는 표 7에 나타내었다.

백합나무 추출물의 MMP-1 생성 억제 효과

상기 표 7의 결과에서 알 수 있듯이, 다양한 추출방법을 통해 얻은 본 발명의 백합나무 추출물은, 어떤 추출 방법에 의하든지, MMP-1 생성 억제율에 있어서 양성 대조군인 TGF-β과 유사한 정도의 우수한 활성을 보임을 알 수 있었다.

실험예 7. 백합나무 추출물의 콜라겐 합성 증진 효과

인체 정상 섬유아세포를 48-웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 1 × 105 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어, 백합나무 추출물의 최종농도를 50㎍/㎖으로 하여 무혈청의 DMEM 배지로 교체한 실험군과 백합나무 추출물이 포함되지 않은 무혈청의 DMEM 배지로 교체한 대조군을 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드 (PICP) 양을 키트 (Takara, 일본)를 이용하여 새로 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. PICP 양은 ng/㎖ 환산하였으며, 양성대조군으로 역시 TGF-β(10ng/ml)를 사용하였다. 콜라겐 생합성 증가율은 하기 수학식 6에 의해 구하였으며, 그 결과를 표 8에 나타내었다.

백합나무 추출물의 콜라겐 합성 증진 효과

상기 표 8의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 백합나무 추출물의 콜라겐 합성 증진 효과는 양성 대조군인 TGF-β와 유사한 효과가 있으며, 또한, 다양한 추출용매를 이용한 통상적인 추출 방법뿐만 아니라, 초임계 추출법, 초음파 추출법, 발효 추출법 또는 포제법에 의해 추출된 어떤 추출물에서도 서로 유사한 활성 정도의 콜라겐 합성 증진효과가 있음을 알 수 있었다.

<처방예>

이하 처방예를 제시하나, 본 특허가 본 처방예들에 한정되는 것은 아니다. 또한 백합나무 추출물은 상기 실시예 1에서 제조된 백합나무 추출물 1%(w/v)를 50% 1,3-부틸렌 글리콜에 녹인 것을 사용하였다.

처방예 1. 유연화장수

백합나무 추출물을 함유한 화장료 중 유연화장수의 처방예는 다음과 같다.

처방예 2. 수렴화장수

백합나무 추출물을 함유한 화장료 중 수렴화장수의 처방예는 다음과 같다.

처방예 3. 영양화장수

백합나무추출물을 함유한 화장료 중 영양화장수의 처방예는 다음과 같다.

처방예 4. 영양크림

백합나무 추출물을 함유한 화장료 중 영양크림의 처방예는 다음과 같다.

처방예 5. 맛사지 크림

백합나무 추출물을 함유한 화장료 중 맛사지 크림의 처방예는 다음과 같다.

처방예 6. 에센스

백합나무 추출물을 함유한 화장료 중 에센스의 처방예는 다음과 같다.

처방예 7. 팩 제형

백합나무 추출물을 함유한 화장료 중 팩의 처방예는 다음과 같다.

실험예 8. 백합나무 추출물을 함유하는 화장료의 주름 개선 효과 평가

본 발명의 화장료의 피부 주름 개선 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다. 처방예 4의 백합나무 추출물을 각각 3%(v/v)를 함유하고 있는 영양 크림과 처방예 4에서 백합나무 추출물을 정제수로 대체한 크림을 비교처방예 3으로, 처방예 4의 백합나무 추출물을 주름개선효과가 있는 것으로 알려진 물질인 아데노신으로 대체한 크림을 비교처방예 4로 제조하였다. 30명의 30∼40세 여성 중 외부 활동을 많이 하는 여성을 무작위로 3개 군으로 나누어 처방예 4와 비교처방예 3 및 비교처방예 4의 크림을 매일 아침 저녁 2회씩 세안 후 크림 적당량을 눈가를 중심으로 2개월간 연속적으로 바르게 하였다. 각 피검자의 주름 개선 효과를 육안 관찰을 통하여 평가하고, 유효율(%)은 피부 주름 개선 효과가 우수하거나 약간 있는 숫자를 전체 피검자숫자로 나눈 값을 백분율로 구하였으며, 결과는 하기의 표 16에 나타내었다.

백합나무 추출물을 함유하는 화장료의 피부 주름 개선 효과(육안평가)

상기 표 16의 결과에 의하면, 본 발명의 백합나무 추출물을 함유한 화장료는 비교 처방예 3의 크림에 비하여 우수한 피부 주름 개선 효과를 보여주었을 뿐만 아니라, 주름개선 효과가 있는 것으로 알려진 성분인 아데노신을 포함하는 비교처방예 4의 크림과 유사한 효과를 나타내었으며, 본 발명의 화장료을 피부에 도포한 피검자들에게서 피부 자극을 관찰할 수 없었다.

실험예 9. 백합나무 추출물을 함유하는 화장료의 피부 탄력 개선효과

본 발명의 백합나무 추출물을 함유하는 화장료의 피부 탄력 개선효과에 대한 임상실험을 실시하였다. 임상시험은 각 화장료의 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.

즉, 상기 표 12, 처방예 4의 백합나무 추출물을 각각 3%(v/v)를 함유하고 있는 영양 크림과 처방예 4에서 백합나무 추출물을 정제수로 대체한 비교처방예 3, 백합나무 추추물을 주름개선효과가 있는 것으로 알려진 물질인 아데노신으로 대체한 비교 처방예 4의 크림을 실험에 사용하였다.

실험자 (20세∼35세의 여성) 20명을 대상으로 실험군을 두 부류로 나누고, 한 군은 얼굴 오른쪽 부위에는 처방예 4를, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교 처방예 3을, 다른 한 군은 비교 처방예 4를 각각 1일 2회씩 연속 8주간 도포하였다. 실험 완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2 개월간 사용 후의 피부 탄력을 각각 피부 탄력 측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하고, 실험 결과를 하기 표 17에 Cutometer SEM 575의 △R8값으로 나타내었다. 이러한 △R8값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.

피부 탄력 개선 효과

상기 표 17의 결과에서도 알 수 있듯이, 유효성분으로 백합나무 추출물을 함유한 제형예 4의 크림은 백합나무 추출물을 함유하지 않는 비교 제형예 1의 크림에 비해 약 3배 이상 우수한 피부 탄력 개선 효과를 나타내었고, 아데노신을 함유하는 비교 제형예 2의 화장료 조성물과 비교하여 유사한 피부 탄력 개선 효과를 나타내어 본 발명의 백합나무 추출물을 함유하는 화장료 조성물이 우수한 피부 탄력 개선 효과가 있음을 알 수 있다.

실험예 10. 백합나무 추출물을 함유하는 화장료의 피지 분비 억제 효과

본 발명의 백합나무 추출물을 함유하는 화장료의 피지 분비 억제 효과를 확인하기 위해 피지 분비량이 많은 20대 남녀 30명을 대상으로 세 개의 그룹으로 나누어 아래와 같은 실험을 실시하였다.

실험은 상기 실시예 1에서 수득한 백합나무 추출물을 포함하는 유연화장수를 상기 표 9의 처방예 1의 조성으로 제조하고, 이때 피지 분비 억제 효과의 비교를 위해 백합나무 추출물 대신 정제수가 함유된 화장수(비교 처방예 1), 백합나무 추출물 대신 피지분비억제 효과가 있다고 알려져 있는 백굴채 추출물(70% 에탄올로 추출하고 50% 1,3-부틸렌 글리콜에 녹인 1.0%(w/v) 백굴채 추출물)이 함유된 화장수(비교 처방예 2)의 제형을 이용하여 실험하였다. 즉, A 그룹에는 백합나무 추출물이 함유된 처방예 1의 유연 화장수를, B 그룹에는 백합나무 추출물이 함유되지 않은 비교 처방예 1을, C 그룹에는 피지분비억제효과가 있다고 알려져 있는 백굴채 추출물이 함유된 비교 처방예 2를 매일 아침, 저녁 세안 후 4주간 사용하도록 하였다. 피지 측정은 세안 후 30분간 항온, 항습실에서 안정시킨 후 피지측정기(Sebumeter)를 이용하여, 이마에서 피지량을 측정하였다. 시험을 위한 유연 화장수를 사용하기 전 피지량을 초기값으로 설정하였으며, 해당 유연 화장수를 지속적으로 사용하면서 매주 1회 4주간 피지량의 변화를 측정하였다. 본 발명의 백합나무 추출물에 의한 피지량의 변화는 초기 피지량과 비교하여 피지 억제 효능 여부를 판정하였으며, 그 결과는 표 18에 나타내었다.

피지 분비 억제 효과

상기 표 18의 결과에서 알 수 있듯이, 시간이 경과함에 따라 본 발명의 백합나무 추출물을 첨가한 처방예 1 처리군의 피지분비량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 백합나무 추출물이 피지 분비를 조정해주어 과다 피지 분비에 의한 모공 확장 억제 기능을 갖는 화장료로서 이용가능성이 있음을 알 수 있다.

실험예 11. 백합나무 추출물을 함유하는 화장료의 피부 보습력 개선 효과

본 발명의 백합나무 추출물을 함유하는 화장료의 피부 보습력 개선효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

피부 질환이 없는 20∼40대 40명을 대상으로 1조 당 20명의 두 개의 그룹으로 나누어, 각 그룹 별로 상기 표 의 처방예 1 및 비교 처방예 1의 유연화장료 조성물을 이용하여 피부 보습력 개선효과를 비교하였다. 즉, 본 발명의 백합나무 추출물을 함유하는 화장수(처방예 1), 백합나무 추출물 대신 정제수가 함유된 화장수(비교 처방예 1)를 매일 2회씩 1개월간 얼굴 및 전박부에 도포하게 하여 TEWA meter를 이용하여 피부 보습상태를 측정하여 개선정도를 평가하여 하기 표 19에 나타내었다.

피부 보습력 개선 효과(기기평가)

상기 표 19의 기기 측정에 의한 피부 보습력 개선 효과 평가 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 백합나무 추출물을 함유하는 화장료(처방예 1)는 백합나무 추출물을 함유하지 않는 화장료(비교 처방예 1)에 비하여 피부 보습력 개선 효과가 매우 우수하였다. 또한, 사용 2주 후 및 사용 4주 후 보습력 개선 효과를 측정한 결과도 마찬가지로, 본 발명의 백합나무 추출물을 함유하는 화장료를 사용하면 피부 보습력 개선 효과가 개선되어 우수함을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.