본 발명은 카르복시티오에스테르 부분, 바람직하게는 α-카르복시티오에스테르 부분을 갖는 제 1 성분 및 N-치환된, 바람직하게는 Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올을 갖는 제 2 성분을 포함하는 성분들의 화학적 라이게이션으로, 라이게이션 부위에 N-치환된 아미드 결합을 갖는 라이게이션 생성물을 얻기 위한 방법 및 조성물을 지시한다. 본 발명의 반응물은 화학선택적이고, 알킬 또는 아릴 티올 부분은 라이게이션 생성물로부터 제거가능하다. 알킬 또는 아릴 티올의 제거는
라이게이션 부위에 천연 아미드 결합을 부여한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 펩티드 및 폴리펩티드의 라이게이션에 특히 유용하다. 본 발명의 라이게이션 시스템은 광범위한 분자들에 적용이 가능하므로, 라이게이션 부위에 천연 아미드 결합을 갖는 폴리머를 함유한 펩티드, 폴리펩티드 및 다른 아미노산을 생성하도록 활용될 수 있다. 확장된 천연 화학적 라이게이션{EXTENDED NATIVE CHEMICAL LIGATION} 화학적 라이게이션은 제 1 화학
성분과 제 2 화학 성분간의 선택적 공유 연결의 형성을 포함한다. 제 1 및 제 2 성분상에 존재하는 유일하고, 상호 반응적인 작용기는 라이게이션 반응을 화학선택적으로 만드는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 및 폴리펩티드의 화학적 라이게이션은 적합성의 유일하고, 상호-반응적인 C-말단 및 N-말단 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드의 화학선택적 반응을 포함한다. 여러 상이한 화학법들은, 예를 들어, 천연 화학적 라이게이션 (Dawson,et al., Science(1994) 266:776-779; Kent,et al.,WO 96/34878; Kent,et al.,WO 98/28434), 옥심 형성 화학적 라이게이션 (Rose,et al., J. Amer. Chem. Soc.(1994) 116:30-34), 티오에스테르 형성 라이게이션 (Schnolzer,et al., Science(1992)
256:221-225), 티오에테르 형성 라이게이션 (Englebretsen,et al., Tet, Letts.(1995) 26(48):8871-8874), 히드라존 형성 라이게이션 (Gaertner,et al., Bioconj. Chem.(1994) 5(4):333-338), 및 티아졸리딘 형성 라이게이션 및 옥사졸리딘 형성 라이게이션 (Zhang,et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(1998) 95(16): 9184-9189; Tamet al.,WO 95/00846; 미국 특허 제 5,589,356)을 포함하는 목적으로 사용되어 왔다. 이러한 방법들 중에서, 오직 천연 화학적 라이게이션 접근법만이 라이게이션 지점에 천연 아미드 (즉, 펩티드) 결합을 갖는 라이게이션 생성물을 산출한다. 본래의 천연 화학적 라이게이션 방법론 (Dawsonet al., 상기; 및 WO
96/34878)은 라이게이션 지점에서 천연 아미드 결합을 생성하기 위한 확고한 방법론을 증명하였다. 천연 화학적 라이게이션은 C-말단 α-카르복시티오에스테르 부분을 갖는 제 1 펩티드 또는 폴리펩티드 단편과, N-말단 시스테인 잔기를 갖는 제 2 펩티드 또는 폴리펩티드 간의 화학선택적 반응을 포함한다. 티올 교환 반응은 초기 티오에스테르-연결 중간 물질을 수득하는데, 이는 시스테인 측쇄 티올을 재생하는 동안 자발적으로 재배열하여 라이게이션 지점에 천연 아미드 결합을 갖게 한다. 본래의 천연 화학적 라이게이션 접근법의 1차적 결점은 N-말단 시스테인을 필요로 한다는 점, 즉, 라이게이션 지점에 시스테인을 갖는 펩티드 및 폴리펩티드 단편의 결합만을 허용한다는 점이다. 이 결점에도 불구하고, 시스테인 이외의 N-말단 아미노산을 갖는 펩티드의 천연 화학적 라이게이션이 보고되었다 (WO98/28434). 이 접근법에서, 라이게이션은 C-말단 α-카르복시티오에스테르를 갖는 제 1
펩티드 또는 폴리펩티드 및 N-말단을 화학식 HS-CH2-CH2-O-NH-[펩티드]로 표현되는 N-{티올-치환된 보조}기로 갖는 제 2펩티드 또는 폴리펩티드를 사용하여 수행된다. 라이게이션 후, N-{티올 치환된 보조}기는 HS-CH2-CH2-O-보조기를 절단함으로써 제거하여 라이게이션 지점에 천연 아미드 결합을 생성한다. 이 방법의 한 제한점은 머캅토에톡시 보조기의 사용이 오직 글리신 잔기에서만 아미드 결합 형성을 성공적으로 가져올 수 있다는 것이다. 이는 절단 후 제 2 펩티드 또는 폴리펩티드 단편의 N-치환 아미노산의 지점에서 글리신 잔기를 생성하는 라이게이션 생성물을 생산한다. 이와 같이, 방법의 이러한 구체예는 반응의 라이게이션 생성물이 이 지점에 글리신 잔기를 함유하도록 할 때에만 적당하고, 라이게이션 수율, 전구체의 안정성, 및 O-연결된 보조기를 제거하는 능력에 관한 어떠한 사건에서도 문제가
될 수 있다. HSCH2CH2NH-[펩티드]와 같은, 다른 보조기가 사용될 수 있음에도 불구하고, 반응을 글리신 잔기에서의 라이게이션으로 제한하지 않으면, 이러한 보조기는 라이게이션된 생성물로부터 제거될 수 없다. 따라서, 요구되는 것은, 효과적이고 손쉽게 제거될 수 있는 티올-함유 보조기에 의하여 천연 화학적 라이게이션을 다양한 종류의 상이한 아미노산 잔기, 펩티드, 폴리펩티드, 폴리머 및 다른 분자로 확장하고, 이러한 분자들을 라이게이션 지점에 천연 아미드 결합과 함께 결합시키는, 널리 적용가능하고 확고한 화학적 라이게이션 시스템이다. 본 발명은 이들 및 다른 요구를 제기한다. 발명의 개요 본 발명은 확장된 천연 화학적 라이게이션에 관련된 방법 및 조성물을 지시한다. 본 발명의 확장된 천연 화학적 라이게이션 방법은 다음 화학식의 N-치환된아미드-연결 초기 라이게이션을 생성하는 단계를
포함한다: J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 Ⅰ 또는 J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2 Ⅱ 상기 식에서 J1은 하나 이상의 임의적으로 보호되는 아미노산 측쇄를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드의 부분, 폴리머, 염료, 적당히 기능화된 표면, 링커 또는 검출가능한 마커이거나, 또는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 천연 화학적 라이게이션에 적합성인 어떠한 다른 화학적 부분이고; R1, R2 및 R3은 독립적으로 H이거나 또는 C1에 접합된 전자-공여기이고; 단, R1, R2 및 R3 중 적어도 하나는 C1에 접합된 전자-공여기를 포함하고; J2는 하나 이상의 임의적으로 보호되는 아미노산 측쇄를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이거나, 또는 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드의 부분, 폴리머, 염료, 적당히 기능화된 표면, 링커 또는 검출가능한 마커이거나; 또는 화학적 펩티드
합성 또는 확장된 천연 화학적 라이게이션에 적합성인 어떠한 다른 화학적 부분이다. 라이게이션 생성물은 화학식 J1-C(O)SR의 카르복시 티오에스테를 포함하는 제 1 성분을, 다음 화학식의 산 안정 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 포함하는 제 2 성분에 라이게이션하는 공정에 의하여 제조된다: HS-C2-C1(R1)-HN-J2 Ⅲ 또는 HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-HN-J2 Ⅳ 여기에서 J2, R1, R2, 및 R3은 위에 정의된 것과 같고, N-치환된 아미드-연결 라이게이션 생성물로부터 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올을 임의적으로 제거한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 절단은 펩티드 적합성 절단 조건 하에서 C1에 공명 안정화된 양이온을 형성함으로써 용이해진다. N으로부터 알킬 또는 아릴 티올 사슬의 제거는 다음 화학식의 최종 라이게이션 생성물을 생성한다: J1-C(O)-HN-J2
Ⅴ 여기에서 J1, J2, R1, R2 및 R3은 위에 정의된 것과 같다. 본 발명은 또한 이러한 확장된 천연 화학적 라이게이션을 초래하기 위한 조성물 및, 이 조성물을 포함하는 카트리지 및 키트를 지시한다. 조성물은 다음 화학식의 완전히 보호되거나, 부분적으로 보호되거나 또는 완전히 비보호된 산에 안정한 N-치환된, 바람직하게는 Nα-치환된, 2 또는 3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 포함한다. SX2-C2-C1(R1)-X1N-CH(Z2)-C(O)-J2 Ⅵ 또는 SX2-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-X1N-CH(Z2)-C(O)-J2 Ⅶ 여기에서 X1은 H 또는 아미노 보호기이고; X2는 H 또는 티올 보호기이고; J2, R1, R2 및 R3은 위에 정의된 것과 같고; Z2는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 천연 화학적 라이게이션에 적합성인 (아미노산 측쇄를 포함하되, 이에 제한되지 않는) 어떤 화학적
부분이다. 본 발명은 또한 라세미체 또는 부분입체 이성질체가 실질적으로 없는 본 발명의 이러한 화합물의 키랄 형태를 지시한다. 본 발명은 나아가 이러한 완전히 보호되거나, 부분적으로 보호되거나 또는 완전히 비보호된 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 생산하는 용액 상 및 고체 상 방법을 지시한다. 이들 화합물을 생산하기 위한 방법은 할로겐-중재 아미노 알킬화, 환원성 아미노화, 및 고체 상 펩티드 합성 방법과 적합성인 Nα-보호된, N-알킬화된, S-보호된, 아미노 알킬- 또는 아릴-티올 아미노산 전구체의 제조를 포함한다. 카르복시티오에스테르 성분의 J1 부분은 카르복시티오에스테르 및 확장된 천연 화학적 라이게이션을 위한 반응 조건에 적합성인 어떤 화학적 부분을 포함할 수 있고, 본 발명의 N-치환된 성분은 단독으로 또는 광범위한 화학적 부분과 결합하여 제공될 수 있는데, 이러한 화학적 부분은 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산
또는, 염료, 햅텐, 카르보히드레이트, 지질, 고체 지지물, 생물적합성 폴리머 또는 다른 폴리머 등과 같은 다른 화학적 부분을 포함한다. 본 발명의 확장된 천연 화학적 라이게이션 방법은 확고하며 중성 pH 부근 및 실온 조건의 범위에서 수성 시스템에서 수행될 수 있다. 본 발명의 N-치환된 성분을 생산하는 방법 또한 확고하며, 광범위한 합성 경로를 놀랍도록 높고 순수한 수율에서 이들 신규 화합물에게 제공한다. 본 발명의 Nα-보호되거나, N-알킬화되거나, S-보호된, 아미노 알킬- 또는 아릴- 티올 아미노산은 전통적 펩티드 합성 및 다른 유기 합성 전략을 이용한 빠른 자동 합성에 특히 유용하다. 더욱이, 본 발명의 보호된 N-치환된 성분은 3개 이상의 단편 라이게이션 계획 또는 수렴성 라이게이션 합성 계획과 같은, 다수의 라이게이션 전략을 포함하는 펩티드를 생산하는 것과 같은 때에, 화학적 라이게이션의유용성을 다중-성분 라이게이션 계획으로 확장시킨다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및
조성물은 원하는 분자의 제 1 부분을 합성하는데에 카르복시티오에스테르 및 N-치환된 성분의 제 1 쌍을 사용하도록 허용하고, 분자의 추가적인 부분을 합성하는데에 카르복시티오에스테르 및 N-치환된 성분의 추가적인 쌍을 사용하도록 허용한다. 그 다음 각각 이러한 합성의 라이게이션 생성물은 함께 라이게이션 되어 (적당한 탈보호 및/또는 변경 후) 원하는 분자를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 천연 화학적 라이게이션의 범위를 크게 확장하고, 본 발명의 시작, 중간 및 최종 생성물은 광범위한 사용을 발견한다. 본 발명은 아미드 결합을 통해 넓은 범위의 펩티드, 폴리펩티드, 다른 폴리머 및 다른 분자의 라이게이션을 허용하도록 천연 화학적 라이게이션의 기술을 확장하기 위한 방법 및 조성물에 관련된다. 도
1은 펩티드의 확장된 천연 화학적 라이게이션을 중재하는 본 발명의 능력을 나타냄으로써 본 발명을 예증하고; 동일한 개요도가 어떤 적당한 분자의 라이게이션을 초래하는데에 채택될 수 있다. 도면에 나타난 것과 같이, 제 1 성분은 화학식 J1-HN-CH(Z1)-αCO-SR의 α-카르복실 티오에스테르를 함유하고, 제 2 성분은 화학식 HS-C2-C1(R1)-NHα-CH(Z2)-C(O)-J2의 N-말단 산에 안정한 Nα-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올을 함유한다. 성분 J1 및 J2는, 보호되거나 비보호된 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 다른 폴리머, 염료, 링커 등과 같은, 화학선택적 라이게이션 반응에 적합성인 어떤 화학적 부분이 될 수 있다. Z1은, 보호되거나 또는 비보호된 아미노산의 측쇄와 같은, Nα-치환된 아미노산에 적합성인 어떠한 측쇄 기이다. R1은 바람직하게는 C1에 대해 오르토 또는 파라 위치에 있는 전자-공여기로 치환된 벤질 부분(페닐로서 지칭되지
않는다면, C1에 있어서 지칭될 때는 벤질); 또는 (치환되지 않거나, C1에 대해 오르토 또는 파라 위치에서 히드록시 또는 티올로 치환된) 피콜릴이다. 티올 교환은 COSR 티오에스테르 성분 및 아미노 알킬 티올 성분 사이에서 일어난다. 교환은, 5-원 고리 중간물을 통한 자발적인 재배열 후 화학식 J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-C(O)-J2의 제 1 라이게이션 생성물을 생성하는 티오에스테르-연결 중간 라이게이션 생성물을 생성하는데, 이 화학식은 라이게이션 부위에 제거 가능한 N-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-]을 갖는다. 라이게이션 부위에 Nα-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-]은, 펩티드-적합성 조건 하에서 제거되어 라이게이션 부위에 천연 아미드 결합을 갖는 화학식 J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2의 최종 라이게이션 생성물을
생성할 수 있다. 도 2는 펩티드의 확장된 천연 화학적 라이게이션을 중재하는 본 발명의 능력을 나타냄으로써 본 발명을 예증하고; 동일한 개요도가 어떤 적당한 분자의 라이게이션을 초래하는데에 채택될 수 있다. 도면에 나타난 것과 같이, 제 1 성분은 화학식 J1-HN-CH(Z1)-αCO-SR의 α-카르복실 티오에스테르를 함유하고, 제 2 성분은 화학식 HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-NHα-CH(Z2)-C(O)-J2의 산에 안정한 Nα-치환된 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올을 함유한다. 성분 J1 및 J2는, 보호되거나 비보호된 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 다른 폴리머, 염료, 링커 등과 같은, 화학선택적 라이게이션 반응에 적합성인 어떤 화학적 부분이 될 수 있다. Z1은, 보호되거나 또는 비보호된 아미노산의 측쇄와 같은, Nα-치환된 아미노산에 적합성인 어떠한측쇄 기이다. R1이 수소 이외의 것일 때, R2 및 R3은 수소이고, R1은
치환되지 않거나 또는 C1에 대해 오르토 또는 파라 위치에서 전자-공여기로 치환된 페닐 부분; (치환되지 않거나, 또는 C1에 대해 오르토 또는 파라 위치에서 히드록시 또는 티올로 치환된) 피콜릴; 메탄티올; 또는 설폭시메틸이다. R2 및 R3이 수소 이외의 것일 때, R1은 수소이고, R3 및 R2는 C1에 대해 오르토 또는 파라 위치에서 전자-공여기로 치환된 벤질기이거나; 또는 (치환되지 않거나, 또는 C1에 대해 오르토 또는 파라 위치에서 히드록시 또는 티올로 치환된) 피콜릴이다. 티올 교환은 COSR 티오에스테르 성분 및 아미노 알킬 티올 성분 사이에서 일어난다. 교환은, 6-원 고리 중간물을 통한 자발적인 재배열 후 화학식 J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1-C2(R2)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-C(O)-J2의 제 1 라이게이션 생성물을 생성하는 티오에스테르-연결 중간 라이게이션 생성물을 생성하는데, 이 화학식은 라이게이션 부위에 제거 가능한
N-치환된 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]을 갖는다. 라이게이션 부위에 Nα-치환된 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]은, 펩티드-적합성 조건 하에서, 제거되어 라이게이션 부위에 천연 아미드 결합을 갖는 화학식 J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2의 최종 라이게이션 생성물을 생성할 수 있다. 도 3은 다중-성분 확장된 천연 화학적 라이게이션 개요도를 예증한다.도 1에서 구체화된 것과 같이 화학식 HS-C2-C1(R1)-Nα(PG1)-CH(Z2)-C(O)-J2의 Nα-보호된 N-말단 폴리펩티드 Nα-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올을 갖는 폴리펩티드 α-카르복실 티오에스테르는 N-말단 Cys 잔기를 함유한 펩티드와 반응한다.R1은 치환되지 않거나, 바람직하게는 C1에 대해 오르토 또는 파라 위치에서 전자-공여기로 치환된
페닐; 또는 (치환되지 않거나, C1에 대해 오르토 또는 파라 위치에서 히드록실 또는 티올로 치환된) 피콜릴이다. 보호기 (PG1)는, 알킬카르보닐 보호기 (예를 들어, 벤질옥시카르보닐 (Z), Boc, Bpoc, Fmoc 등), 트리페닐메틸 보호기 (Trt), 2-니트로페닐설페닐 보호기 (Nps) 등과 같은 어떠한 적당한 보호기가 될 수 있다. 보호기는 제 1 라이게이션 반응 후 제거된다. 제 1 천연 화학적 라이게이션 반응은도 1에서 구체화된 것과 같이 화학식 HS-C2-C1(R1)-Nα(PG1)-CH(Z2)-C(O)-J2의 Nα-보호된 N-말단 폴리펩티드 Nα-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올을 갖는 폴리펩티드 α-카르복실 티오에스테르 및 N-말단 Cys-펩티드 간에서 수행되어 화학식 HS-C2-C1(R1)-Nα(PG1)-CH(Z2)-CH-펩티드2-펩티드3의 제 1 라이게이션 생성물을 얻는다. 그 다음 보호기 PG1을 제거하여 화학식
HS-C2-C1(R1)-Nα(H)-CH(Z2)-C(O)-펩티드2-펩티드3의 라이게이션 생성물을 얻는다. 그 다음 이 종을 제 3의, 티오에스테르-함유 성분과 반응시킨다. 티올 교환은 COSR 티오에스테르 성분 및 아미노 N-{알킬 티올} 성분 사이에서 일어난다. 교환은, 5-원 고리 중간물을 통한 자발적인 재배열 후 화학식 펩티드1-C(O)-Nα (C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-C(O)-펩티드2-Cys-펩티드3의 제 2 라이게이션 생성물을 생성하는 티오에스테르-연결 중간 라이게이션 생성물을 생성하는데, 이 화학식은 제 2 라이게이션 부위에 제거 가능한 N-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-]을 갖는다. 제 2 라이게이션 부위에 Nα-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-]은, 펩티드-적합성 조건 하에서, 제거되어 제 1 및제 2 라이게이션 부위에 천연 아미드 결합을 갖는 화학식
펩티드1-C(O)-NαH-CH(Z2)-C(O)-펩티드2-펩티드3의 최종 라이게이션 생성물을 생성할 수 있다. 도 4는 본 밞명의 두 개의 상이한 1-페닐-2-머캅토에틸 보조기를 채택한 일반 라이게이션 전략을 예증한다. 도 5a및5b는 실시예 21에 설명된 것과 같이 Nα-1-(4-메톡시페닐)-2-머캅토에틸 보조기를 사용한 시토크롬 b562에 대한 라이게이션 반응의 분석적 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 결과를 나타낸다.도 5a는 시간=0일 때 라이게이션 반응의 상태를 나타낸다.도 5b는 반응을 하루밤동안 진행시킨 후 라이게이션의 상태를 나타낸다.도 5b에서 또한 나타난 것과 같이, Nα-1-(4-메톡시페닐)-2-머캅토에틸 보조기의 C1에 있는 비키랄 중심의 결과인 두 개의 라이게이션 생성물이 관찰된다. 도 6a및6b는
Nα-{1-(4-메톡시페닐)-2-머캅토에타노}-변경된 N-말단 단편을 가지고 한 확장된 천연 화학적 라이게이션을 이용함으로써 형성된 라이게이션 생성물인 시토크롬 b562 잔기 1-106의 재구성된 전자분무 질량 분석법(MS)을 나타낸다. C-말단 α티오에스테르를 갖는 시트크롬 b562 잔기 1-63은 N-말단 Nα-{1-(4-메톡시페닐) 2-머캅토에타노} 글리신을 갖는 시토크롬 b562 잔기 64-106에 라이게이션 된다.도 6a는 라이게이션 부위에서 제거 가능한 Nα-{1-(4-메톡시페닐) 2-머캅토에타노} 기를 포함하는 초기 라이게이션 생성물의 MS 재구성을 나타낸다.도 6b는 Nα-{1-(4-메톡시페닐) 2-머캅토에타노} 기를 제거하기 위해 플루오르화 수소 (HF) 처리하여 라이게이션 부위에서 천연 아미드 결합을 생성한 후의 라이게이션 생성물의 MS 재구성을 나타낸다. 관찰된 질량은 11948±1Da (HF 처리 전) 및 11781±1Da이었는데, 다시
말해 167±2Da의 결손은 1-(4-메톡시페닐) 2-머캅토에타노 보조기의 제거로 기대되는 166Da 결손과 양호하게 일치한다. 도 7a및7b는도 6b에서 서술된 직선 시토크롬 b562 시료의 대표적인 분석적 HPLC (도 7a), 및 폴딩 후 시료의 이온 교환 크로마토그램 (도 7b)을 예증한다. 특정 구체예의 설명 본 발명은 확장된 천연 화학적 라이게이션에 관련된 방법 및 조성물을 지시한다. 일반적으로, 방법은 카르복실 티오에스테르, 더욱 바람직하게는 α-카르복실 티오에스테르를 포함한 제 1 성분을, 산에 안정한 N-치환된, 바람직하게는 Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 포함한 제 2 성분에 라이게이션 시키는 것을 포함한다. 제 1
성분의 카르복시티오에스테르와 제 2 성분의 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 티올 간의 화학선택적 반응은 티오에스테르-연결된 중간물을 통해 진행되고, 초기 라이게이션 생성물로 분해된다. 보다 명확하게 말하자면, COSR 티오에스테르 성분 및 아미노 알킬 티올 성분 간에 발생하는 티올 교환은 티오에스테르-연결된 중간물 라이게이션 생성물을 생성하는데, 이 생성물은 자발적인 재배열 후 아미노 알킬 티올 성분이 화학식 I 또는 II 중 어떤 것을 갖느냐에 의존하여 5-원 또는 6-원 고리 중간물을 통해 아미드-연결된 제 1 라이게이션 생성물을 생성한다: J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 Ⅰ 또는 J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2 Ⅱ 상기 식에서 J1, J2, R1, R2 및 R3은 위에 정의된 것과 같다. 라이게이션 지점에 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는
아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-] 또는 [HS-(C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]은 펩티드-적합성 조건 하에서, 생성물의 손상 없이 제거되어 화학식 III의 최종 라이게이션 생성물을 생성할 수 있다: J1-C(O)-HN-J2 Ⅴ 여기에서 J1, J2, R1, R2 및 R3은 위에 정의된 것과 같다. 최종 라이게이션 생성물은 라이게이션 부위에 천연 아미드 결합을 갖는다. 더욱 특히, 본 발명의 확장된 천연 화학적 라이게이션 방법은 (i) 화학식 J1-C(O)SR의 α-카르복실 티오에스테르를 포함하는 제 1 성분의 화학적 라이게이션 및 (ii) 화학식: J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 Ⅰ 또는 J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2 Ⅱ (상기 식에서 J1, J2, R1, R2 및 R3은 위에 정의된 것과 같다)의 산에 안정한 N-치환된 2 또는
3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 포함하는 제 2 성분의 화학적 라이게이션을 포함한다. R1, R2 및 R3 기는 펩티드 적합성 절단 조건 하에서 N-C1 결합의 절단을 용이하게 하도록 선택된다. 예를 들어, 전자-공여기는, 특히 C1에 접합되어 있다면, 절단을 용이하게 하는 C1에서 공명 안정화된 양이온을 형성하는데 이용될 수 있다. 화학적 라이게이션 반응은 바람직하게 부형제로서 티올 촉매를 포함하고, 수성 또는 혼합된 유기-수성 조건의 대략 중성 pH 조건에서 수행된다. 제 1 및 제 2 성분의 화학적 라이게이션은 자발적으로 재배열이 일어나 N-치환된 아미노 연결된 라이게이션 생성물을 산출하는 5 또는 6 원 고리를 통해 진행될 수 있다. 제 1 및 제 2 성분이 펩티드 또는 폴리펩티드이면, N-치환된 아미드 연결 라이게이션 생성물은 다음의 화학식을 가진다: J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 Ⅷ J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2
Ⅸ 상기 식에서 J1, J2 및 R1, R2, R3 및 Z2는 위에 정의된 것과 같다. N-치환된 아미드 결합 라이게이션 생성물의, 접합된 전자-공여기 R1, R2 또는 R3은 N-C1 결합의 절단 및 N-치환된 아미드-연결 라이게이션 생성물로부터 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 제거를 용이하게 한다. 펩티드 적합성 절단 조건 하에서 N의 알킬 또는 아릴 티올 사슬의 제거는 라이게이션 지점에 천연 아미드 결합을 갖는 라이게이션 생성물을 생성한다. 제 1 및 제 2 성분이 펩티드 또는 폴리펩티드이면, 라이게이션 생성물은 다음의 화학식을 가질 것이다: J1-CONαH-CH(Z2)-C(O)-J2 Ⅹ 본 발명은 종래 화학적 라이게이션 접근법에 걸친 다수의 장점을 제공한다. 몇몇 이러한 장점은 본 발명의 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올성분의 미세하게 조율된 성질에 관련된다. 첫째로, 라이게이션 되지 않은
N-치환된 성분은 산성 조건에 안정하여, 이는 그것의 확고한 합성 및 저장을 허용한다. 둘째로, 이것은 카르복시티오에스테르 성분과 선택적으로 반응하여 라이게이션 부위에 N-치환된 아미드 결합을 갖는 초기 라이게이션 생성물을 생성한다. 셋째로, 초기 라이게이션 생성물의 라이게이션 부위의 Nα 위치에 재생된 알킬 또는 아릴 티올 부분은, 비보호되거나, 부분적으로 보호되거나 또는 완전히 보호된 펩티드, 폴리펩티드 또는 다른 부분에 완전히 적합성인 조건 하에서 선택적으로 제거될 수 있는데, 이는 곧, 알킬 또는 아릴 티올 부분은 원하는 라이게이션 생성물을 손상시키지 않고 제거될 수 있다는 것이다. 선택적 절단 반응은, 산성, 광분해성, 또는 환원성 조건과 같은 표준 펩티드-적합성 절단 조건하에서, 손쉽게 수행될 수 있는데 이러한 조건은 라이게이션에 선택된 특정 N-치환된 알킬 또는 아릴 티올 부분에 의존한다. 그러므로, 본 발명의 또 다른 장점은 라이게이션 성분의 잔존한 부분 상에 하나
이상의 기는, 만약 존재한다면, 의도된 최종 사용에 의존하여 비보호되거나, 부분적으로 보호되거나, 또는 완전히 보호될 수 있다는 것이다. 더욱이, 카르복시 티오에스테르 및 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 화학선택적 특성 및 용해성이 주어진다면, 라이게이션 반응은 실온 근처의 수성 조건 하에서 pH 7 정도에서 높은 생성물 수율을 얻도록 신속하고 정확하게 수행될 수 있다. 이것은 본 발명이 온후한 조건 하에서 부분적으로 또는 완전히 비보호된 펩티드, 폴리펩티드 또는 다른 폴리머를 라이게이션하는데에 특히 유동적이도록 한다. 본 발명의 N-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 성분을 함유하는 펩티드 성분에 대하여, 이 화합물은 아래의표 1에 묘사된 것과 같이 다음의 화학식을 갖는다: HS-C2-C1(R1)-NHα-CH(Z2)-C(O)-J2 XI J2 및 R2는 아래 설명된 것과 같고; Z2는 아미노산의 측쇄와
같은, N-치환된 아미노산에 적합성인 어떠한 측쇄 기이다. R1은 바람직하게는 C1에 대해 오르토 또는 파라 위치에서 전자-공여기로 치환된 페닐기; 또는 (치환되지 않거나, C1에 대해 오르토 또는 파라 위치에서 히드록시 또는 티올로 치환된) 피콜릴 기이다. 오르토 또는 파라 위치에서 페닐 및 피콜릴 전자-공여 치환기인 R1', R3' 및 R5'의 위치결정은 라이게이션 후 N-C1 결합의 절단을 향상시키기 위해 C1 탄소로의 전자적 접합을 유지시킬 필요가 있다. R1', R3' 및 R5'에 대한 바람직한 전자-공여기는 메톡시 (-OCH3), 티올 (-SH), 히드록시 (-OH), 메틸티오 (-SCH3)와 같은 강한 전자-공여기, 및 메틸 (-CH3), 에틸 (-CH2-CH3), 프로필 (-CH2-CH2-CH3),
이소프로필 (-CH(CH3)2)과 같은 중간 전자-공여기를 포함한다. R1' R3' 및 R5' 중 어떤 것 또는 모두는 H가 될 수 있도록 제공된다. 일반적으로 강한 전자-공여기는 라이게이션 후의 절단에 대한 2-탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 민감성을 향상시키는 것으로 관찰된다. 단일 전자-공여기가 R1', R3' 및 R5' 치환기로서 존재할 때, 라이게이션 반응은 더 빠른 속도로 진행될 수 있고, 반면 절단은 더 느리거나 또는 더욱 긴축인 절단 조건을 요구한다. 둘 이상의 전자-공여기가 R1', R3' 및 R5' 치환기로서 존재할 때, 라이게이션 반응은 더 느릴 수 있고, 반면 절단은 더 빠르거나 또는 덜 긴축인 절단 조건을 요구한다. 그러므로 특정 전자-공여기는 이에 따라서 선택될 수 있다. 본 발명의 또다른 구체예는 N-치환된 2 탄소 사슬 화합물에 관련되는데, 이는 R1' 및 R5' 위치에서 R1의 치환기로서 티올을 포함한다. C1에
접합된 전자-공여기가 되는 것 이외에, 이러한 위치의 한 쪽 또는 둘 모두에 티올의 도입은 화합물이 R1 기를 통해 중재되는 6-원 고리를 통해서 (뿐만 아니라 Nα-2 탄소 사슬 알킬 티올에 의한 5-원 고리를 통해서) 라이게이션 될 수 있게 한다. 이것은 또한 α-카르복시 티오에스테르와 반응하는데에 이용가능한 티올의 국소적 농도를 증가시키고, 라이게이션을 개선할 수 있는 구조적 구속에 의해 추가적인 형태에 제공된다. 본 발명의 Nα-치환된 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 성분을 지칭할 때, 이 화합물은 화학식 HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-NHα-CH(Z2)-C(O)-J2를 갖고, 이는아래표 2에 묘사된다. 위에 설명된 것과 같이, J2는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 천연 화학적 라이게이션에 적합성인 어떠한 화학적 부분이 될 수 있고, Z2는 아미노산의 측쇄와 같은, N-치환된 아미노산에 적합성인 어떠한 측쇄 기이다. R1이
수소 이외의 것일 때, R2 및 R3은 수소이고, R1은 치환되지 않거나 또는 C1에 대해 오르토 또는 파라 위치에서 전자-공여기로 치환된 페닐 부분; (치환되지 않거나, 또는 C1에 대해 오르토 또는 파라 위치에서 히드록시 또는 티올로 치환된) 피콜릴; 메탄티올; 또는 설폭시메틸이다. R2 및 R3이 수소 이외의 것일 때, R1은 수소이고, R3 및 R2는 C1에 대해 오르토 또는 파라 위치에서 전자-공여기로 치환된 벤질기이거나; 또는 (치환되지 않거나, 또는 C1에 대해 오르토 또는 파라 위치에서 히드록시 또는 티올로치환된) 피콜릴이다. N-치환된 2 탄소 사슬 화합물에 관하여, 오르토 또는 파라 위치에서 벤질 및 피콜릴 전자-공여 치환기 R1', R3' 및 R5'의 위치결정은 라이게이션 후 Nα-결합의 확고한 절단을 위해 C1 탄소로의 전자적 접합을 유지시킬 필요가 있다. 그러나, R2 및 R3가 C2 및 C3과 벤질기를 형성할 때, R1' 및 R3' 중 적어도
하나는 강력한 전자-공여기를 포함하는데, 여기에서 R1' 또는 R3'은 메톡시 (-OCH3), 티올 (-SH), 히드록시 (-OH), 및 티오메틸 (-SCH3)로부터 선택된다. R2 및 R3이 수소인 N-치환된 3 탄소 사슬 티올에 대하여, R1은 R1', R3' 및 R5'가 강력한 또는 중간의 전자-공여기, 또는 그들의 조합을 포함하는 벤질 또는 피콜릴기를 포함한다. N-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올에 관하여, 강력한 전자-공여기는 라이게이션 후 절단에 대한 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 민감성을 향상시킨다. 그러므로 특별한 전자-공여기 또는 그것의 조합은 그에 따라 선택될 수 있다. N-치환된 2 탄소 사슬 화합물과 유사하게, 본 발명의 N-치환된 3 탄소 사슬 화합물은 흥미있는 구성체에서 치환에 대하여 이용가능할 때 R1' 및 R5' 위치에서 R1'의 치환기로서 티올을 포함한다. 여기서 다시, 전자-공여 티올기는 C1에 접합되고 이 위치에서 그것의
도입은 화합물이 라이게이션 사건을 형성하는 6-원 고리에 대한 두 개의 경로를 갖게 할 수 있다. 이는 또한 이용가능한 티올의 국소 농도를 α-카르복시 티오에스테르와 반응하도록 증가시키고, 라이게이션을 개선할 수 있는 구조적 구속에 의한 추가적인 형태에 제공한다. 본 발명의 N-말단 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 아미노산의 합성은, 여기 설명된 것과 같이 수행될 수 있고 (예를 들어개요도 I및개요도 II), 업계에 공지된 표준 유기 화학 기술에 따라서 수행될 수도 있다. 예를 들어, "Advanced Organic Chemistry Mechanisms, and Structure", 4th Edition, J. March (Ed.), John Wiley & Sons, New York, NY, 1992; "Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional
Group Preparations", R. Larock (Ed.), VCH Publishers, New York, NY, 1989를 참조한다. 이 아미노산은 용액에서, 폴리머-지지 합성에 의해, 또는 그들의 조합으로 합성될 수 있다. 바람직한 접근법은 N 알파 보호 N 알킬화 S-보호된 아미노 알킬- 또는 아릴- 티올 아미노산 전구체를 채택한다. 합성에 이용되는 시약은 다수의 제조사로부터 얻을 수 있다. 또한, 시작 성분 및 개개의 아미노산 유도체와 같은, 다양한 중간물이 차후 사용을 위해 저장될 수 있고, 키트 등으로 제공될 수 있다는 것이 잘 이해될 것이다. 본 발명의 N-말단 Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 아미노산의 제조에, 보호기 전략이 채택된다. 일반적으로 다양한 합성 전략에 사용되는 바람직한 보호기 (PG)는 고체상 펩티드 합성 (Solid Phase Peptide Synthesis, "SPPS")과 적합성이다. 몇몇 예에서, 상이한
조건 하에서 제거 가능한 직교성 보호기를 사용하는 것이 또한 필요하다. 많은 이러한 보호기는 공지되고 본 목적에 적당하다 (예를 들어, "Protecting Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition, T. W. Greene and P.G.M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; "Syythetic Peptides, A User's Guide", G.A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook ofCombinatorial & Solid Phase Organic Chemistry", W.D. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R. Rhodes, and H.H.
Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; 및 "Protecting Groups", P.J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994 참조). 예는 벤질옥시카르보닐 (Z), Boc, Bpoc, Trt, Nps, FmocCl-Z, Br-Z; NSC; MSC, Dde 등을 포함한다. 황 부분에 대하여, 적당한 보호기의 예는 벤질, 4-메틸벤질, 4-메톡시벤질, 트리틸, Acm, TACAM, 크산틸, 디설피드 유도체, 피콜릴, 및 페나실을 포함하지만 이에
제한되지 않는다. 더욱 특별하게, Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올은개요도 I(Nα-치환된 전구체의 고체-상 제조),개요도 II(Nα-치환된 전구체의 용액-상 제조)에 따라서 제조될 수 있다.개요도 I에서, Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올은 폴리머-지지 유기 합성의 표준 방법을 이용하여 고체 상에 직접 집합하고, 반면개요도 II의 Nα-보호된, N-알킬화된, S-보호된, 아미노알킬 또는 아릴티올 아미노산 전구체는 표준 커플링 프로토콜을 이용하여 레진에 커플링 된다.개요도 I에서, X는 할로겐이고, R1 및 R2는 위에 설명된 것과 같고 보호되거나 보호되지 않은 부분으로서 사전형성되거나 또는 레진-결합으로 정교하게 제작될 수 있고, J2는 바람직하게 X-CH(R)-J2-레진으로서 할로겐에 부착되는데, 여기에서 R은 수소 또는 다른 측쇄이다. 베타 또는 감마 아미노산
또는 유사한 분자의 합성에서와 같은, 예를 들어 할로겐 X 및 J2-레진이 하나 이상의 탄소에 의해 분리되면, J2가 다양한 기일 수 있다는 것이 인정될 것이다. 글리옥살 부분 (HC(O)-C(O)-J2-레진이 채택되면, 결과적 측쇄 R은 수소이다.개요도 II에서, X는 할로겐이고, R1 및 R2는 위에 설명된 것과 같고 보호되거나 보호되지 않은 부분으로서 사전형성되거나 또는 용액내에서 또는 레진-결합으로 정교하게 제작될 수 있고, 여기에서 R은 수소 또는 다른 측쇄이다. 글리옥살산 부분 (HC(O)-C(O)-J2-레진이 채택되면, 결과적 측쇄 R은 수소이다. 위에 언급한 것과 같이,개요도 I및II는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 합성에 적용될 수 있다는 것이 인정될 것이다. 라세미 또는 부분입체 이성질체 생성물이 생산되면, 확장된 천연 화학적 라이게이션에 이용하기 전에 이들을 표준 방법으로 분리하는 것이 필요할 수 있다. (개요도
I) (개요도 II) 본 발명의 확장된 천연 화학적 라이게이션에 이용되는 제 1 성분의 카르복시 티오에스테르 부분을 지칭할 때, 이 성분은 화학식 J1-CO-SR을 갖는다. 더욱 바람직한 카르복시 티오에스테르 성분은 화학식 J1-NH-C(Z1)-CO-SR의 α-카르복실 티오에스테르 아미노산을 포함한다. J1 기는, 보호되거나 보호되지 않은 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 다른 폴리머, 염료, 링커 등과 같이, 화학선택적 라이게이션 반응에 적합성인 어떠한 화학적 부분일 수 있다. Z1은 아미노산의 측쇄와 같이, αCO-SR 티오에스텔에 적합성인 어떠한 측쇄 기이다. R은 티오에스테르기와 융합성인 어떤 기인데, 아릴, 벤질, 및 알킬기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. R의 예는 3-카르복시-4-니트로페닐 티오에스테르, 벤질 에스테르, 및 머캅토프로프리온산 류신 에스테르를 포함한다 (Dawsonet al., Science
(1994) 266: 776-779; Canneet al., Tetrahedron Lett. (1995) 36: 1217-1220; Kent,et al., WO 96/34878; Kent,et al., WO 98/28434; Ingenitoet al., JACS (1999) 121(49): 11369-11374; 및 Hackenget al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96: 10068-10073 참조). 다른 예는 디티오트레이톨 또는, 알킬 또는 아릴 티오에스테르를 포함하는데, 이는 또한 주지된 인테인-중재 생물학적 기술 (Chonget al., Gene (1997) 192:277-281; Chonget al., Nucl. Acids Res. (1998) 26:5109-5115; Evanset al., Protein Science (1998)
7: 2256-2264; 및 Cottonet al., Chemistry & Biology (1999) 6(9): 247-256 참조)로 생산될 수 있다. α-카르복시티오에스테르는, 실시예를 포함하여 여기 설명된 것과 같은, 업계에 공지된 표준 기술 후 화학적 또는 생물학적 방법에 의해서 생성될 수 있다. 화학적 합성을 위하여, α-카르복시티오에스테르 펩티드는 용액내 또는 티오에스테르-생성 레진으로부터 합성될 수 있는데, 이 기술은 주지된다 (예를 들어, Dawsonet al.,상기; Canneet al.,상기; Hackenget al.,상기, Hojo H, Aimoto, S. (1991)Bull Chem soc Jpn64:111-117). 예를 들어, 화학적으로 합성되는 티오에스테르 펩티드는 상응하는 펩티드 α-티오산으로부터 만들어질 수 있는데, 이는 차례로 티오에스테르-레진 상에서 또는 용액 내에서
합성될 수 있지만, 레진 접근법이 바람직하다. 펩티드-α-티오산은 상응하는 3-카르복시-4-니트로페닐 티오에스테르, 상응하는 벤질 에스테르, 또는 다양한 알킬 티오에스테르의 어떤 것으로 전환될 수 있다. 이 모든 티오에스테르는, 상응하는 벤질 티오에스테르보다 어느 정도 더 빠른 반능 속도를 예증하는 3-카르복시-4-니트로페닐 티오에스테르를 가지고 한, 라이게이션 반응에 만족스러운 이탈기를 제공하는데, 이는 차례로 알킬 티오에스테르보다 더 반응적일 수 있다. 또 다른 예로서, 트리틸-결합 머캅토프로프리온산 류신 티오에스테르-생성 레진은 C-말단 티오에스테르를 구성하는데 사용될 수 있다 (Hackenget al., 상기). C-말단 티오에스테르 합성은 또한 3-카르복시프로판설폰아미드 안전-장치 링커를 이용하여 디아조메탄 또는 요오드아세토니트릴로 활성화시킨 후 적당한 티올로 대치함으로써 성취될 수 있다 (Ingenitoet al.,상기; Shin et al.,
(1999)J. Am. Chem. Soc., 121, 11684-11689). 펩티드 또는 폴리펩티드 C-말단 α-카르복시티오에스테르는 또한 생물학적 과정을 이용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 친화도 태그 (tag)와 같은 표지를 사용하거나 또는 사용하지 않는 인테인 발현 시스템은, 적당한 티올이 존재할 때 C-말단 티오에스테르 펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 생성하도록 "인테인" 단백질-스플라이싱 요소의 유도성 자가-절단 활성을 촉진하는데 이용될 수 있다. 특히, 인테인은 DTT, β-머캅토에탄올, β-머캅토에탄설폰산, 또는 시스테인과 같은 티올이 존재할 때 특이적 자가-절단이 일어나는데, 이는 C-말단 티오에스테르를 갖는 펩티드 단편을 생성한다. 예를 들어, Chong et al., (1997) 상기; Chong et al., (1998) 상기; Evans et al., 상기; 및 Cotton et al., 상기를 참조한다. 제
1 카르복시티오에스테르 성분을 갖는 본 발명의 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 성분의 라이게이션은, 라이게이션 지점에 N-치환된 아미드 결합을 갖는 라이게이션 생성물을 생성한다. 반응의 라이게이션 조건은 N-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 부분을 갖는 티오에스테르의 선택적인 반응성을 유지하도록 선택된다. 바람직한 구체예에서, 라이게이션 반응은 pH 6 내지 8, 바람직한 pH범위는 6.5 내지 7.5인 완충용액에서 수행한다. 완충용액은 수성, 유기성 또는 그들의 혼합물이 될 수 있다. 라이게이션 반응은 또한 하나 이상의 촉매 및/또는 하나 이상의 환원제, 지질, 세제, 다른 변성제 또는 용해제 등을 포함할 수 있다. 바람직한 촉매의 예는 티올 및 포스핀으로, 이는 티오페놀, 벤질머캅탄, TCEP 및 알킬 포스핀과 같은, 부분을 함유한다. 변성 및/또는 용해제의 예는 구아니디늄, 물 또는 TFE, HFIP, DMF, NMP와 같은 유기 용매
중 유레아, 물과 혼합한 아세토니트릴, 또는 구아니디늄과 혼합한 아세토니트릴 및 물 중 유레아를 포함한다. 온도는 또한 라이게이션 반응의 속도를 조절하는데 이용될 수 있는데, 이는 보통 5℃에서 55℃ 사이이고, 바람직한 온도는 15℃에서 40℃ 사이이다. 한 예에서, 라이게이션 반응은 6.8 내지 7.8 사이의 pH에서 6M 구아니디늄 중 2% 티오페놀을 갖는 반응 시스템에서 양호하게 진행한다. N-치환된 2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올에 대하여, 라이게이션 사건은 COSR 티오에스테르 성분 및 아미노 알킬 티올 성분 사이에서 발생하는 티올 교환으로부터 일어난다. 교환은, 5-원 고리 중간물을 통한 자발적인 재배열 후 화학식 J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-J2의 제 1 라이게이션 생성물을 생성하는 티오에스테르-연결 중간 라이게이션 생성물을 생성하는데, 이 화학식은 라이게이션 지점에 제거 가능한 N-치환된 2 탄소 사슬 알킬
또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-]을 가지며 치환기는 위에 정의된 것과 같다. 라이게이션 지점에 N-치환된2 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-]은, 펩티드-적합성 조건 하에서, 제거되어 라이게이션 지점에 천연 아미드 결합을 갖는 화학식 J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2의 최종 라이게이션 생성물을 생성할 수 있다. N-치환된 3 탄소 사슬 아릴 또는 알킬 티올에 대하여, COSR 티오에스테르 성분 및 아미노 알킬 티올 성분 간의 티올 교환은 6-원 고리 중간물을 통한 자발적인 재배열 후 화학식 J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1-C2(R1)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-J2의 제 1 라이게이션 생성물을 생성하는 티올에스테르-연결 중간 라이게이션 생성물을 생성하는데, 이 화학식은 라이게이션 지점에 제거 가능한 N-치환된 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]을
갖는다. 라이게이션 지점에 N-치환된 3 탄소 사슬 아릴 티올 [HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]은, 펩티드-적합성 조건 하에서, 제거되어 라이게이션 지점에 천연 아미드 결합을 갖는 화학식 J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2의 최종 라이게이션 생성물을 생성할 수 있다. N-치환된 알킬 또는 아릴 티올기의 제거는 바람직하게 N-C1 결합의 절단을 용이하게 하기 위해 산성 조건에서 수행되어, 라이게이션 지점에 안정화되고, 치환되지 않은 아미드 결합을 산출한다. "펩티드-적합성 절단 조건"에 의하여, 펩티드와 적합성이고 라이게이션 생성물로부터 알킬 또는 아릴 티올 부분의 절단에 적당한 물리-화학적 조건이 의도된다. 일반적으로 펩티드-적합성 절단 조건은 채택되는 α-치환된 화합물에 의존하여 선택되는데, 이 조건은 일상적이고 주지된 접근법을 통해 손쉽게 추론될 수 있다 (예를 들어, "Protecting Groups in Organic
Synthesis", 3rd Edition, T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Eds., John Wiley &Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide", G.A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry", W.D. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R. Rhodes, and H.H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky, Ed.,
Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; 및 "Protecting Groups", P.J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994 참조). 예를 들어, R1, R2 또는 R3 치환기가 메톡시, 히드록시, 티올 또는 티오메틸, 메틸 등을 포함할 때, 제거를 위한 더욱 보편적인 방법은 펩티드 합성 화학법에 대하여 전형적인 산성 절단 조건을 포함한다. 이것은 강한 산성 조건 또는 물-산성 조건 하에서, 환원제 및/또는 스캐빈져 시스템 (예를 들어, 무수 플루오르화 수소 (HF), 트리플루오로아세트산 (TFA), 또는 트리메틸술포닐 플루오르아세트산 (TMSFA)등과 같은 산)을 갖거나 갖지 않고, N-C1 결합의 절단을
포함한다. 더욱 특유한 산성 절단 시스템은 주어진 구조에 대한 아릴 또는 알킬 티오 부분을 제거하기 위해 Nα-C1 결합을 최적화하도록 선택될 수 있다. 이러한 조건은 주지되고 펩티드 본래 모습을 유지시키는 것에 적합성이다. 절단을 위한 또다른 방법은 펩티드 또는 폴리펩티드 서열에 존재하는 트립토판에 티올 스캐빈져를 포함하여 유리된 아릴 또는 알킬 티올 부분과 트립토판 측쇄와의 반응을 회피하도록 하는 것을 포함한다. 티올 스캐빈져의 예는 에탄디올, 시스테인, 베타-머캅토에탄올 및 티오크레졸을 포함한다. 따라서, 본 발명의 또다른 구체예는 N-C1 결합을 절단하여 아릴 또는 알킬 티올 부분을 제거할 때 티올 스캐빈져를 첨가하는 것이다. 다른 전문화된 절단 조건은 피콜릴기가 치환기일 때 광 또는 환원-절단 조건을 포함한다. 예로서, R1, R2 및 R3 치환기가 피콜릴 부분을 포함할 때, 광분해 (예를 들어, 자외선광), 아연/아세트산 또는 전자분해 환원이 표준 프로토콜 후
절단에 이용될 수 있다. N-치환된 2 탄소 사슬 티올의 R1이 R1에 티오메탄을 포함하면, 수은(II) 또는 HF 절단이 이용될 수 있다. 절단 시스템은 또한 제 1 또는 제 2 라이게이션 성분이 다른 보호기를 포함할 때 고체 지지물로부터의 동시 절단 및/또는 탈보호제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, N-피콜릴기는 활성화된 아연 (~0.5g/ml)으로, 10% 아세트산/물 용액에서 폴리펩티드를 용해함으로써 제거될 수 있다. 2-머캅토, 1-메틸설피닐에탄기 (SH-C2-C1(S(O)-CH3)-Nα)와 같은, 티오메탄기는 라이게이션 후 환원 및 수은, 머캅탄-중재 절단에 의해 제거될 수 있다. 예로서, 티오메탄 형태로의 환원을 위해, 메틸설피닐에탄기는 N-메틸머캅토아세트아미드 (MMA)를 함유한 수성 3% 아세트산 용액에 폴리펩티드를 용해함으로써(예를 들어, 0.5ml 아세트산/물 및 0.05 ml의 MMA 중 1 mg 폴리펩티드) 제거될 수 있고, 그 다음 하루밤동안 반응시킨 후
혼합물을 냉동하고 동결건조한다. 그 다음 환원된 보조기는 아세트산 수은 (Hg(OAC)2)를 함유한 3% 아세트산의 수용액에서 제거될 수 있고(예를 들어, 약 1시간동안 물 및 10mg의 Hg(OAC)2중 0.5ml 아세트산), 그 다음베타-머캅토에탄올을 첨가한다 (예를 들어, 0.2ml 베타-머캅토에탄올). 그 다음 생성물은, 역상 HPLC (RPHPLC)와 같은, 표준 방법으로 정제될 수 있다. 인정될 수 있는 것으로서, 하나 이상의 스캐빈져, 세제, 용매, 금속 등과 같은, 하나 이상의 촉매 및/또는 부형제가 또한 사용될 수 있다. 일반적으로, 특정 스캐빈져의 선택은 존재하는 아미노산에 의존한다. 예를 들어, 스캐빈져의 존재는, 절단 도중 생산되는 카르보늄 이온이 어떤 아미노산 (예를 들어, Met, Cys, Trp, 및 Tyr) 상에 가질 수 있는 손상 효과를 억제하는데에 이용될 수 있다. 세제, 폴리머, 염, 유기 용매 등과
같은 다른 첨가제는 용해도를 조정함으로써 절단을 개선하도록 채택될 수 있다. 산화 환원 시스템을 조정하는 촉매 또는 다른 화학물이 또한 이로울 수 있다. 완충용액 시스템, pH 및 온도와 같은 다양한 다른 물리-화학적 조건이 주어진 절단 시스템을 최적화하는데 평이하게 조절될 수 있다는 것이 또한 손쉽게 명확할 것이다. 본 발명은 본 발명의 Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 보호된 형태를 제공한다. 이들 조성물은 화학식 (PG1)S-C2-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2 또는 (PG1)S-C3 (R3)-C2(R2)-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2의 완전히 보호된, 부분적으로 보호된 또는 완전히 보호되지 않은 산에 안정한 Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 포함하는데, 이는 아래표 Ⅲ및표 IV에 묘사된다. 특히 하나 이상의 R1, R2 및 R3은,
Nα-치환된 아미드 알킬 또는 아릴 티올로 Nα-치환된 아미노 알킬 또는 아릴 티올의 전환 후, 펩티드 적합성 절단 조건 하에서 Nα-C1 결합의 절단을 용이하게 하는 공명 안정화된 양이온을 C1에서 형성할 수 있는, C1에 접합된 전자-공여기를 포함한다. PG1 및 PG2는 개별적으로 또는 조합으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있고 동일하거나 상이할 수 있는 결합기인데, 여기에서 Z2는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 천연 화학적 라이게이션과 적합성인 어떠한 화학적 부분이고, J2는 화학적 펩티드 합성 또는 확장된 천연 화학적 라이게이션에 적합성인 어떠한 화학적 부부분이다. PG1 (또는 X1)은 아민을 보호하기 위한 기이다. PG2 (또는 X2)는 티올을 보호하기 위한 기이다. 많은 이러한 보호기가 공지되고 본 목적에 적당하다 (예를 들어, "Protecting Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition, T.W. Greene and
P.G.M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide", G.A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, NY, 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry", W.D. Bennet, J.W. Christensen, L.K. Hamaker, M.L. Peterson, M.R. Rhodes, and H.H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide
Synthesis, 2nd ed.", M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; 및 "Protecting Groups", P.J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994 참조). PG1 및 X1에 대한 바람직한 보호기의 예는 [Boc(t-부틸카르바메이트), Troc (2,2,2,-트리클로로에틸카르바메이트), Fmoc(9-플루오르에닐메틸카르바메이트), Br-Z 또는 Cl-Z(Br- 또는 Cl-벤질카르바메이트), Dde(4,4,-디메틸-2,6-디옥소시클로에틸-일리덴), MsZ(4-메틸설피닐벤질카르바메이트), Msc(2-메틸설포에틸카르바메이트), Nsc(4-니트로페닐에틸설포닐-에틸옥시-카르보닐)]을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 PG1 및 X1 보호기는 "Protecting Groups in Organic Synthesis"
(Greene and Wuts, Third Edition, Wiley-Interscience, (1999))로부터 선택되고 Fmoc 및 Nsc가 가장 바람직하다. PG2에 대한 바람직한 보호기의 예는 [Acm(아세트아미도메틸), MeoBzl 또는 Mob(p-메톡시벤질), Meb(p-메틸벤질), Trt(트리틸), Xan(크산테닐), tButhio(s-t-부틸), Mmt(p-메톡시트리틸), 2 또는 4 피콜릴(2 또는 4 피리딜), Fm(9-플루오르에닐-메틸), tbut(t-부틸), Tacam(트리메틸아세트아미도메틸)]을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 보호기 PG2 및 X2는 "Protective Groups in Organic Synthesis" (Green and Wuts, Third Edition,Wiley-Interscience, (1999))로부터 선택되고, Acm, Mob, MeB, 피콜릴이 가장 바람직하다. 직교 보호 계획은 화학적 기작을 다르게
함으로써 제거되고, 그러므로 다른 분류의 어떠한 순서로 및 존재로 제거될 수 있는 둘 이상의 분류 또는 군을 포함한다. 직교 계획은 실질적으로 더 온화한 총체적 조건의 가능성을 제공하는데, 이는 선택성이 반응 시간 보다는 화학법에서의 차이점에 기초를 두어 성취될 수 있기 때문이다. 본 발명의 Nα-치환된 2 또는 3 사슬 알킬 또는 아릴 티올의 보호된 형태는 위의 개요도 Ⅰ 및 Ⅱ에서와 같이 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물은, 할로겐-중재 아미노 알킬화, 환원성 아민화를 포함하는 어떠한 다양한 수단 및, 고체상 아미노산 합성 방법과 적합성인 Nα-보호된, N-알킬화된, S-보호된, 아미노 알킬- 또는 아릴-티올 아미노산 전구체에 의해서 생산될수 있다. 바람직하다면, 허용되는 키랄 순도의 화합물을 부여하기 위해 생산된 라세미체 또는 부분입체 이성질체의 분해는, 표준 방법에 의해 수행될 수 있다. 위에 언급한 것과 같이, 허용되는 키랄 순도의
Nα-치환된 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴은 어떤 예에서 바람직하다. 실시예 21 및 도 5b에서 나타난 것과 같이, 시토크롬 b562의 제조에서 Nα-1-(4-메톡시페닐)-2-머캅토에틸 보조기의 사용은 겹친 정제 프로필을 갖는 두 개의 라이게이션 생성물 (부분입체 이성질체)을 산출한다. Nα-보조기의 제거는 단일 주 생성물을 산출함에도 불구하고, 결손 및 부반응 생성물의 적은 퍼센트가 최종 생성물에 존재할 수 있는데, 이는 바람직하지 않을 수 있다. 예를 들어, 실시예 4부터 6에 설명된 것과 같이 cyt b562 합성에 채택된 Nα-1-(4-메톡시페닐)-2-머캅토에틸 보조기의 합성을 위해 채택된 환원성 아민화 합성 경로는, 원래 키랄 중심 C1에서 양쪽 에피머 (epimer)의 생산을 일으킨다. 위에 언급한 것과 같이, 원한다면, 허용되는 키랄 순도의 화합물을 얻게 하도록 생산된 라세미체 또는 부분입체 이성질체의 분할을 표준 방법으로써 수행할 수 있다. 허용되는
키랄 순도를 갖는 본 발명의 Nα-보조기를 얻기 위한 표준 접근법은: (1) 키랄 크로마토그래피; (2) 키랄 합성; (3) 공유 부분입체 이성질체 접합의 사용; 및 (4) 거울상체적으로 순수한 키랄 보조기를 부여하기 위한 결정화 또는 다른 전통적인 분리 방법이다 (예를 들어, Ahuja, Satinder.'Chiral separations. An overview.' ACS Symp. Ser. (1991), 471 (Chiral Sep. Liq. Chromatogr.), 1-26; Collet, Andre."Separation and Purification of Enantiomers by CrystallizationMethods", In: Enantiomer (1999) 4: 157-172; Lopata et al., J. Chem. Res. Minipprint (1984) 10: 2930-2962; Lopata et al., J. Chem. Res. (1984) 10:
2953-2973; Ahuja, Satinder.'Chiral separations and technology: an overview. 'Chiral Sep. (1997), 1-7; Chiral Separations: Applications and Technology. Ahuja, Satinder; Editor. USA. (1997), 349 pp. Publisher: (ACS, Washington, D. C. 참조). 이 모든 표준 방법 접근법은 허용되는 키랄 순도의 화합물을 부여하도록 라세미체 또는 부분입체 이성질체의 분할에 이용될 수 있다. 예를 들어, 결정화는 거울상체의 광학 분할에 채택될 수 있다. 키랄 크로마토그래피에 있어서, 라세미체 혼합물은 키랄 배지를 이용한 예비 크로마토그래피에 의해 키랄적으로 순수한 거울상체로 분리될 수 있다는 것이 주지된다. 그러므로, 키랄 Nα-보조기의 총 합성을 위한 환원성 아민화 경로에 의해 생산되는 라세미체 혼합물은, 아미노산 보조기에
대해 아래에 예증된 것과 같이, 키랄적으로 순수한 형태로 각 거울상체를 제조하는데에 이용될 수 있다 (예를 들어, 하기 식에서 R은 아미노산 측쇄이다): 둘 중 하나의 거울상체가 키랄적으로 순수한 형태로 얻어질 수 있거나, 또는 둘 모두가 키랄적으로 순수한 형태로 얻어질 수 있다. 둘 중 하나의 거울상체는, 펩티드 단편 (즉, 두개의 키랄적으로 순수한 에피머)과 같은, 키랄적으로 순수한보조기 변경된 성분을 형성하는데 사용될 수 있는데, 이는 방해됨 없이 다른 에피머 및 그것의 불순물의 존재로부터 엄격하게 정제될 수 있다. 어떤 공급이 양쪽 거울상체를 사용하도록 되지 않는다면, 보조기 총 량의 50%가 소모될 것이라는 점에 주목한다. 예를 들어, 두개의 키랄적으로 순수한 보조기-변경된 펩티드 단편은 분리 ENCL 반응에 사용되어, 키랄적으로 순수한 보조기-변경된 라이게이션 생성물 혼합물을 부여할 수 있다. 분리 정제 후, 보조기는 에피머 라이게이션 생성물로부터 제거되어
(독립적으로 또는 결합된 후에) 동일한 천연 구조인 라이게이션된 생성물을 부여하는데, 이는 그 후에 정제된다. 키랄 합성에 있어서, 바람직한 방법은 아래에 파라-메톡시페닐 치환된 Nα- 탄소 보조기에 대하여 예증된 것과 같이, 거울상체적으로 순수한, 키랄 출발 물질을 채택한다. [PG1 = Boc 또는 Fmoc; PG2 = (4Me)벤질 또는 (4MeO)벤질] 그 다음 결과적인 키랄적으로 순수한 전구체 화합물은 보호된 (N-치환된) 아미노산, 즉: 을 만드는데에 사용되거나 또는 '서브-모노머' 펩토이드 경로, 즉: 에서 직접 사용되어 폴리머 지지체 상에서 보조기-변경된 펩티드를 형성한다. 순차적인 탈보호/절단은 키랄적으로 순수한 형태에서 보조기-변경된 펩티드 단편을 부여한다. 즉: 그러므로 본 발명의 키랄적으로 순수한 Nα-보조기는 공지된 키랄성의 손쉽게 이용가능한 파라-치환된 페닐글리신으로부터 만들어질 수 있으므로,
결과적 보조기의 키랄성 및 키랄 순도를 사전 결정한다. 대안으로, 또다른 바람직한 구체예는 아래 예증된 것과 같은 보조기를 산출하기 위해 비대칭성 환원을 채택한 거울상체선택적 합성을 채택한다: R = -H, 또는 -CH3, 또는 -CH2COOH (또는 반대 거울상체) 비대칭성 환원은 아래 예시된 글리신에 대해서와 같이, Nα-보조기-변경된 아미노산을 산출하도록 거울상체선택적 합성에 이용될 수 있다. 즉: (또는 다른 거울상체) 적당하게 수행된 비대칭성 합성은 한 거울상체의 상당한 초과량을 부여할 것인 반면, 그럼에도 불구하고 다른 거울상체의 양이 존재할 것으로 기대된다. 이것은 순수한 형태로 주요 거울상체를 얻기 위하여 키랄 정제 단계의 이용에 처리될 수 있다. 거울상체선택적 합성 경로의 주된 이점은 키랄 크로마토그래피성 분리가 더 용이하고, 많은 양의 재료가 버려지지 (소모되지) 않는다는 것이다. 또다른 바람직한 표준 기술은 공유 부분입체 이성질체의 접합의 사용에 의한 분할이다. 일반적으로, 이 접근법은 라세미체 보조기 혼합물을 변경하도록 키랄 아미노산 (예를 들어 Ala)을 채택하고, 아래 예증된 것과 같은, 표준 (비-키랄) 크로마토그래피에 의해 결과적 부분입체 이성질체를 분리한다. 예를 들어, 라세미체 보조기 1은 제 2 키랄 중심의 공유적 통합에 의해 부분입체 이성질체의 혼합물로 전환될 수 있다: 이 경우에서, 라세미체 혼합물은 (역위를 가진) SN2 친핵성 반응에 의해, (R)2-Br-프로피온산과 반응하여, 나타난 부분입체 이성질체의 쌍을 산출한다. 사실상, 본 발명자들은 N-연결된 키랄 티올-함유 보조기로 L-Ala을 생성하였다. 부분입체 이성질체로서, 이들 두 개의 화합물은 전형적으로 비키랄 크로마토그래피 조건 하에서 상이한 크로마토그래피성 성질을 나타내고, 실제 예비 조건 하에서 분리가능하여 순수하고 독특한 에피머를 부여한다. Nα부분의 적당한 보호 후, 각 화합물은 N-말단 Ala 잔기를 갖는 비보호된 또는 부분적으로 보호된 키랄적으로 순수한 보조기-변경된 펩티드 단편을 생성하는데에 사용될 수 있다. 본 발명의 보호된 Nα-치환 성분은 특히 전통적인 펩티드 합성 및 다른 유기 합성 전략을 이용한 고속 자동 합성에 유용하다. 이 성분들은 또한 3개 이상의 단편 라이게이션 계획 또는 수렴성 라이게이션 합성 계획과 같은, 다수의 라이게이션 전략을 포함하는 펩티드를 생산하는 것과 같은 때에, 화학적 라이게이션의 유용성을 다중-성분 라이게이션 계획으로 확장시킨다. 예를 들어, 본 발명의 확장된 천연 화학적 라이게이션 방법 및 조성물은, 오르토티오에스테르 및 카르복시에스테르 티올과 같은, 친핵체 안정성 티오에스테르 생성법 및 티오에스테르 안전장치 접근법과 접합하여 채택될 수 있는데, 이는 참고문헌으로서 여기 수록된 공동-계류 중인 출원 PCT 출원 [미지정] (2001. 8.31 제출) 및 미국 가특허 출원 제 60/229,295 호 (2000. 9.1 제출)에 설명된다. 간략하게 말하자면, 친핵체-안정성 티오에스테르 생성 화합물은 오르토티오에스테르 및 카르복시에스테르 티올을 포함한다; 이들 화합물은, 펩티드-, 폴리펩티드- 및 다른 폴리머-티오에스테르의 생성을 포함하는, 유기 합성에서 광범위한 적응성을 갖는다. 친핵체-안정성 티오에스테르 생성 화합물은 강한 친핵체가 채택되는 조건 하에서 만들어진, Fmoc SPPS를 이용하여 만든 펩티드 또는 폴리펩티드와 같은 전구체로부터 활성화된 티오에스테르의 생성은 물론이고, 흥미있는 특이적 라이게이션 또는 접합 반응을 지시하기 위한 적합성 선택적-보호 접근법을 필요로 하는 (또는 이것의 이용으로 이득이 되는) 다중-단계 라이게이션 또는 접합 계획의 생성에 특히 유용하다. 친핵체-안정성 오르토티올로에스테르는 화학식 X-C(OR')2-S-R을 갖는데, 여기에서 X는 하나 이상의 친핵체 절단 가능 보호기를 임의적으로 포함하는 흥미있는 표적 분자이고, R'는 비-친핵성 절단 조건 하에서 제거 가능한 친핵체-안정성 보호기이고, R은 오르토티올로에스테르 -C(OR')-S-와 적합성인 어떤 기이다. 친핵체-안정성 오르토티올로에스테르 티오에스테르-생성 레진이 또한 제공되고, 이는 화학식 X-C(OR')2-S-R-링커-레진 또는 X-C((OR'1-링커-레진)(OR'2))-SR을 갖는데, 여기에서 X, R' 및 R은 위와 같고, 링커 및 레진은 고체상 유기 합성에 이용되기 적당한 어떤 친핵체-안정성 링커 및 레진으로, 절단에 대하여 친핵체-불안정한 링커로 그 후에 전환될 수 있는 안전장치 링커를 포함한다. 친핵체-안정성 오르토티올로에스테르는 산 가수분해 조건과 같은, 다양한 비-친핵성 조건에 의해 활성 티오에스테르로 전환될 수 있다. 친핵체-안정성 카르복시에스테르 티올은 화학식 X-C(O)-O-CH(R")-(CH2)n-S-R"'를 갖는데, 여기에서 X는 하나 이상의 친핵체-불안정성 보호기를 포함하는 흥미있는 표적 분자이고, R"는 비-친핵체 안정성 기이고, n은 1 또는 2 (n=1이 바람직함)이고, R"'는 수소, 보호기 또는 비-친핵성 조건 하에서 제거가능한 레진 또는 보호기에 부착된 산- 또는 환원-불안정성 또는 안전장치 링커이다. 친핵체-안정성 카르복시에스테르 티올-기초 티오에스테르-생성 레진이 또한 제공되고, 이는 화학식 X-C(O)-OCH(R")-CH2n-S-링커-레진 또는 X-C(O)-O-CH(R"-링커-레진)-CH2n-S-R"'를 갖는데, 여기에서 X, R", n 및 R"'는 위와 같고, 링커 및 레진은 고체상 유기 합성의 이용에 적합한 어떤 친핵체-안정성 링커 및 레진이다. 친핵체-안정성 카르복시에스테르 티올은, 티오페놀과 같은 티올 촉매의 첨가에 의해 활성 티오에스테르로 전환될 수 있다. 그러므로 본 발명의 확장된 천연 화학적 라이게이션 방법 및 조성물은 다중-단편 수렴성 라이게이션 기술에 채택될 수 있는데, 여기에서 표적 화합물의 한쪽 말단은 본 발명의 보호된 또는 비보호된 Nα-2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올을 가질 수 있고, 다른 쪽 말단은 활성 티오에스테르 및 라이게이션으로의 전환을 위한 오르토티올로에스테르 또는 카르복시에스테르 티올 부분을 가질 수 있다. 본 발명의 Nα-2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올은 다른 라이게이션 벙법 (예를 들어, 천연 화학적 라이게이션 (Dawson,et al., Science(1994) 266:776-779; Kent,et al.,WO 96/34878; Kent,et al.,WO 98/28434), 옥심 형성 화학적 라이게이션 (Rose,et al., J. Amer. Chem. Soc.(1994) 116:30-34), 티오에스테르 형성 라이게이션 (Schnolzer,et al., Science(1992) 256:221-225), 티오에테르 형성 라이게이션 (Englebretsen,et al., Tet, Letts.(1995) 26(48):8871-8874), 히드라존 형성 라이게이션 (Gaertner,et al., Bioconj. Chem.(1994) 5(4):333-338), 및 티아졸리딘 형성 라이게이션 및 옥사졸리딘 형성 라이게이션 (Zhang,et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(1998) 95(16): 9184-9189; Tamet al.,WO 95/00846; 미국 특허 제 5,589,356))과 조합하거나, 또는 다른 방법 (Yan. L.Z. and Dawson, P.E., "Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization",J. Am. Chem. Soc.2001, 123, 526-533 (참고문헌으로서 여기 수록); Gieselnanet al.,Org. Lett. 2001 3(9):1331-1334; Saxon, E.et al.,"Traceless" Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds. Org. Lett. 2000, 2, 2141-2143)에 의해 채택될 수 있다는 것이 또한 인정될 것이다. 본 발명의 Nα-2또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올에 있는 티올 황의 위치에서의 셀레늄의 치환이 또한 본 발명에 의해 예상된다. 본 발명의 방법 및 조성물은 많은 용도를 갖는다. 본 발명의 방법 및 조성물은 특히 펩티드, 폴리펩티드 및 다른 폴리머를 라이게이션하는데에 유용하다. 자연적으로 발생하는 것은 물론이고 비자연적 아미노산 및 유도체를 포함하는, 실제로 어떤 아미노산에서 천연 화학적 라이게이션을 수행하는 능력은, 천연 화학적 라이게이션의 범위를 적당한 시스테인 라이게이션 부위가 없는 표적으로 확장한다. 본 발명은 또한, 라이게이션 부위에 Nα-치환된 또는 완전히 천연의 이미드 결합을 갖는 링커를 통해 폴리머 등의 부분을 결합하고자 할 때, 펩티드 또는 폴리펩티드 외에 폴리머의 라이게이션에 이용될 수 있다. 본 발명은 또한 발현-단백질 라이게이션 (EPL) 적용을 위한 광범위한 펩티드 표지의 생산에서 용도를 발견한다. 예를 들어, EPL-생성 티오에르테르 폴리펩티드는, 의도되는 최종 용도에 의존하여, Nα-치환된 알킬 또는 아릴 티올 아미드 결합 또는 완전히 천연인 아미드 결합을 통하여 광범위한 펩티드와 라이게이션 될 수 있다. 본 발명은 또한 다양한 고리 펩티드 및 폴리펩티드를 생산하는데에 활용될 수 있는데, 이는 시스테인을 함유하지 않은 펩티드 및 폴리펩티드까지도 고리화의 지점에 천연 아미드 결합을 갖는다. 예를 들어, 산업 표준사항에 의해 생성되는 항생제 및 다른 약물과 같은 대부분의 고리 펩티드가, (머리-꼬리로) 고리화되는 라이게이션 부위에서 천연 아미드 결합을 형성하는데 이용될 수 있는 시스테인 잔기를 함유하지 않기 때문에 이러한 점은 중요하다. 본 명세서에서 언급된 모든 발행물 및 특허 출원은 참고문헌으로서 여기 수록되는데 이는 각각의 개별적 발행물 및 특허 출원이 참고문헌으로서 수록되었음을 명확하고 개별적으로 지적한 것과 동일하다. 다음의 제조 및 실시예는 당업자가 본 발명을 좀 더 명확하게 이해하고 실행할 수 있도록 주어진다. 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서가 아닌, 단지 예증적 및 대표적인 것으로서 고려되어야 한다. 약어 Acm 아세트아미도메틸 Aloc 알리옥시카르보닐 BOP 벤조트리아졸-1-일옥시트리스 (디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 Br,Cl Z Br,Cl 벤질카르바메이트 DCM 디클로로메탄 DDE 4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로엑스 1-일이덴 DIPCDIN, N-디이소프로필카르보디이미드 DIPEAN, N-디이소프로필에틸아민 DMAP 4-디메틸아미노피리딘 DMFN, N-디메틸포름아미드 DMSO 디메틸설폭시드 EtOH 에탄올 Fmoc 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 FM 9-플루오레닐메틸 HATU (N-[(디메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸 [4,5-b] 피리딜메틸렌]-N -메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥시드) HBTU N-[(1-H-벤조트라이졸-1-일)(디메틸아민) 메틸렌]-N- 메틸메탄아 미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥시드 (종래 명칭 0-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸루로늄 헥사플루오로포스페이트) HF 플루오르화 수소산 HMP 레진 4-히드록시메틸페녹시 레진;p알콕시벤질 알콜 레진; 또는 Wang 레진 HOAt 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 HOBt 1-히드록시벤조트리아졸 Mbh 디메톡시벤즈히드릴 MBHA 레진 4-메틸벤즈히드릴아민 레진 Meb p-메틸벤질 MMA N-메틸머캅토아세트아미드 Mmt p-메톡시트리틸 Mob p-메톡시벤질 Msc 2-메틸설포에틸카르바메이트 Msz 4-메틸설피닐벤질카르바메이트 Mtr 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠 설포닐 NMMN메틸모르폴린 NMPN-메틸피롤리딘,N-메틸-2-피롤리딘 Nsc 4-니트로페닐에틸설포닐-에틸옥시카르보닐 OPfp 펜타플루오로페닐 에스테르 OtButert-부틸 에스테르 PAC 펩티드 산 링커 PAL 펩티드 아미드 링커 Pbf 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-설포닐 PEG-PS 폴리에틸렌 글리콜-폴리스티렌 Picolyl 메틸-피리딜 Pmc 2,2,4,6,8-펜타메틸크로만-6-설포닐 PyAOP 7-아자벤조트로아졸-1-1일옥스트리스 (피롤리디노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트 S-tButert-부틸-티오 Tacam 트리메틸아세트아미도메틸 Soctert-부틸옥시카르보닐 TBTU 0-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 우로늄 테트라 플루오로보레이트 tButert-부틸 TFA 트리플루오로아세트산 Tis 트리스이소프로필실라인 Tmob 2,4,6-트리메톡시벤질 TMOF 트리메틸오르토포르메이트 Troc 2,2,2트리클로로에틸카르바메이트 Trt 트리페닐메틸 실시예 1: 일반 재료 및 방법 펩티드는 표준 프로토콜에 따라 PAM 레진 또는 티오에스테르-생성 레진 상에서, Boc-화학법을 위한 제자리 중성화/HBTU 활성화 프로토콜을 이용한 SPPS에 의하여 변경된 ABI 430A 펩티드 합성기 상에서 단계별 방식으로 합성하였다 (Hackeng et al., 상기; Schnolzer at al., (1992) Int. J. Pept. Prot. Res., 40:180-193; 및 Kent, S. B. H. (1988)Ann. Rev. Biochem. 57, 957-984). 사슬 집합 후 펩티드는 5% p-크레졸을 가진 무수 플루오르화 수소로 처리하여 탈보호 및 동시에 절단하였고 동결건조하여 예비 HPLC로 정제하였다. Boc 보호된 아미노산은 Peptides International 및 Midwest Biotech로부터 구입하였다. 트리플루오로아세트산 (TFA)는 Halocarbon에서 구입하였다. 다른 화학물은 Fluka 또는 Aldrich로부터 구입하였다. 분석 및 예비 HPLC는 Rainin HPLC 시스템 상에서 Vydac C4분석 또는 예비를 이용하여 214 nm UV 검출로 수행하였다. 펩티드 및 단백질 정량 분석법은 Sciex API-I 전자분무 질량 분석기 상에서 수행하였다. 실시예 2: 2(4'메톡시벤질티올)브롬화벤질의 제조 10 mmol, 1.4g의 2-히드록시메틸티오페놀을 10 ml의 DMF 중 10 mmol의 4-메톡시벤질클로라이드 및 1.75 ml의 DIEA에서 실온에서 반응시켰다. 반응은 10분에 완료되었다. pH 3인 50 ml의 물을 첨가하였다. 생성물은 에틸 아세테이트로 추출하고 황산 나트륨으로 건조하였다. 그 다음, 수득한 조 오일은 20 ml의 THF 중 11 mmol의 사브롬화탄소 (3.64 g) 및 11 mmol 의 트리페닐포스핀 (2.88 g)으로 반응시켰다. 하루밤동안 반응한 후 THF를 증발시켰다. 헥산/에틸 아세테이트 (6/1)을 이동상으로서 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 생성물을 정제하였다. 1.8 g 회수. 실시예 3: Nα(2-머캅토벤질)글리신-펩티드의 제조 N-말단 Boc-보호된 Ala을 가진 레진 결합 펩티드 (78 mg)에, 순 TFA를 첨가하여 Boc기를 제거하였다. 표준 화학법 프로토콜을 이용하여 Boc글리신O숙신이미드를 레진에 커플링하였다. 커플링이 완료된 후 Boc기를 제거하고 DMF 중 10% 디이소프로필에틸아민으로 2회 세척하여 레진을 중성화하였다. 그 다음 DMF 및 DMSO로 레진을 세척하였다. 그 다음 0.2 ml의 DMSO 및 0.01 ml의 디이소프로필에틸아민 중 9 mg의 2(4'메톡시벤질티오)브롬화벤질을 첨가하였다. 실온에서 12시간동안 혼합물을 반응시켰다. 표준 프로토콜을 이용하여 HF 조건에서 펩티드를 절단하고 탈보호하였다. 2,079 Da의 정확한 양을 가진 최고점은 모든 펩티드 재료의 약 12% (HPLC로 측정)이었다. 정확한 펩티드는 표준 반-예비 HPLC를 이용하여 정제하였다. 실시예 4: 4'-메톡시 2(4'메틸벤질티오)아세토페논의 제조 4 mmol, 0.542 ml의 4-메틸벤질머캅탄 및 4 mmol, 916.3 mg의 4'메톡시2브로모아세토페논을 4 ml DMA에 용해하였다. 그 다음, 4 mmol, 0.7 ml의 디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 1시간동안 실온에서 혼합물을 교반하였다. 혼합물을 희석된 HCl에 붓고 에틸아세테이트로 추출한 후 황산 나트륨으로 건조하였다. 오일을 에틸아세테이트에 용해하고 석유 에테르를 첨가하여 침전시킨 후, 450 mg의 백색 고체를 회수하였다. 실시예 5: 1 아미노,1(4-메톡시페닐),2(4-메틸벤질티오)에탄의 제조 실온에서 1.44 mmol, 411 mg의 4'-메톡시 2(4'메틸벤질티오)아세토페논 및 4.3 mmol, 941 mg의 아미노옥시아세트산을 20 ml의 TMOF에 용해하고 0.047 ml의 메탄설폰산을 촉매로서 첨가하였다. 48시간 후, 용매를 증발시키고 에틸아세테이트에 잔기를 녹이고, 1M 모노히드로겐포타슘 설페이드로 세척한 후 황산 나트륨으로 건조하였다. 실리카 겔 크로마토그래피로 조 생성물을 정제하고 200mg의 옥심 복합체를 수득하였다. 200 mg의 이 옥심 복합체, 0.556 mmol을 2 ml THF에 용해한 후, 1.67 ml의 1M BH3/THF 복합체를 첨가하였다. 27시간 후 출발 물질은 남아있지 않았다. 3 ml의 물을 첨가하고 1.5 ml의 10N 수산화나트륨을 첨가하였다. 1시간동안 혼합물을 환류하였다. 그 다음 혼합물을 에틸아세테이트 (4x)로 추출하고 황산 나트륨으로 건조하였다. 그 다음 최종 생성물 (40 mg)은 실리카 겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 실시예 6: Nα 1-(4-메톡시페닐)2-머캅토 에탄 글리신-펩티드의 제조 N-말단 Boc-보호된 Ala을 가진 레진 결합 모델 펩티드 (78 mg)에, 순 TFA를첨가하여 Boc기를 제거하였다. 표준 화학법 프로토콜을 이용하여 브로모아세트산을 레진에 커플링하였다. 그 다음 0.010 ml의 디이소프로필에틸아민을 가진 0.3 ml의 DMSO 중 1 아미노,1(4-메톡시페닐),2(4-메틸벤질티오)에탄을 레진에 첨가한다. 하루밤동안 반응한 후 레진을 세척하고 표준 HF 프로토콜을 이용하여 펩티드를 절단하고 탈보호하였다. 그 다음, 원하는 생성물은 반-예비 HPLC를 이용하여 정제하였다. 또다른 Nα 1-(4-메톡시페닐)2-머캅토 에탄 글리신-펩티드의 제조 서열 S-Y-R-F-L-폴리머의 모델 펩티드 레진 0.1 mmol에, 표준 커플링 프로토콜을 이용하여 브로모 아세트산을 커플링하였다. 커플링 후 레진은 DMSO로 세척하였다. 그 다음 0.3 ml DMSO 및 0.025 ml의 디이소프로필에틸아민 중 1 아미노,1(4-메톡시페닐),2(4-메틸벤질티오) 에탄 32.5 mg, 0.12 mmol을 첨가하였다. 혼합물을 하루밤동안 반응하게 하였다. 펩티드는 표준 HF 방법을 이용하여 절단하고 탈보호하였다. 조 절단의 HPLC는 전체 생성물의 60%로 원하는 생성물 (MW 2,122)을 나타냈다. n-알킬에탄티오기는 HF에서 97% 안정한 것으로 나타났다. 실시예 7: 2',4'-디메톡시 2(4'메틸벤질티오) 아세토페논의 제조 4-메틸벤질머캅탄, 3.94 mmol, 0.534 ml 및 2'4' 디메톡시 2-브로모아세토페논 3.86 mmol, 1g을 4 ml DMF에 용해하였다. 그 다음 디이소프로필에틸아민, 3.94 mmol, 0.688 ml을 첨가하였다. 실온에서 24시간동안 혼합물을 교반하였다. 혼합물을 포타슘 모노히드로겐설페이트의 1 M 용액에 붓고 에틸아세테이트로 추출한 다음 황산 나트륨으로 건조하였다. 증발 후, 잔기성 오일을 에틸아세테이트에 용해하고석유 에스테르를 첨가함으로써 침전시켜서, 616 mg의 백색 고체를 수득하였다. 실시예 8: 1 아미노,1(2,4-디메톡시페닐),2(4-메틸벤질티오) 에탄의 제조 2',4'-디메톡시 2(4'메틸벤질티오) 아세토페논 0.526 mmol, 166 mg 및 아미노옥시아세트산 1.59 mmol, 345 mg을 6 ml의 TMOF에 용해하고 실온에서 0.034 ml의 메탄설폰산을 촉매로서 첨가하였다. 31시간 후, 용매를 증발시키고 에틸아세트에 녹인 다음, 1M 모노히드로겐포타슘 설페이트준으로 세척하고 황산 나트륨으로 건조하였다. 그 다음 조 생성물은 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 126 mg (61% 수율)의 옥심 복합체를 수득하였다. 126 mg의 옥심 복합체, 0.324 mmol을 1.5 ml의 THF에 용해하였다. 그 다음 0.973 ml의 1M BH3/THF 복합체를 첨가하였다. 54시간 후 출발 물질은 여전히 발견되고 0.5 ml의 1M BH3/THF 복합체를 첨가하였다. 3일 더 후, 즉 총 6일동안 반응한 후에, 3 ml의 물을 첨가하고 1 ml의 10 N 수산화나트륨을 첨가하였다. 1시간동안 혼합물을 환류하였다. 그 다음 혼합물을 에틸아세테이트 (4x)로 추출하고 황산 나트륨으로 건조하였다. 그 다음 실리카 겔 크로마토그래피를 이용하여 최종 생성물 (43 mg)을 정제하였다. 실시예 9: Nα 1-(2,4-디메톡시페닐) 2-머캅토 에탄 글리신-펩티드의 제조 서열 S-Y-R-F-L-폴리머의 레진 결합 펩티드 0.1 mmol에, 표준 커플링 프로토콜을 이용하여 브로모 아세트산을 커플링하였다. 커플링 후 레진은 DMSO로 세척하였다. 그 다음 0.3 ml DMSO 및 0.025 ml의 디이소프로필에틸아민 중 1 아미노,1(2',4'-디메톡시페닐),2(4-메틸벤질티오) 에탄 36 mg, 0.12 mmol을 첨가하였다. 혼합물을 하루밤동안 반응하게 하였다. 펩티드는 표준 HF 방법을 이용하여절단하고 탈보호하였다. 조 절단의 HPLC는 전체 생성물의 42%로 원하는 생성물 (MW 938)을 나타냈다. n-알킬에탄티올기는 HF에서 92% 안정한 것으로 나타났다. 실시예 10: C-말단 SDF1-알라닌-티오에스테르 및 N-말단 Nα(2-머캅토벤질) 글리신-펩티드의 Ala-Gly 화학적 라이게이션 6-원 재배열 라이게이션을 위하여, SDF1-α의 C-말단 Ala 티오에스테르 절편 (MW 4429) 1 mg 및 SDF1-α의 N-말단 Nα(2-머캅토벤질) 글리신 절편 (MW 2079) 0.6 mg을 pH 7.0인 100㎕의 6 M 구아니디늄 완충용액에 용해하고, 1㎕의 티오페놀을 첨가하였다. 실온 (~25℃)에서 2일 후, 원하는 라이게이션 생성물 (MW 5472)의 형성은 ES-MS로 확인하였다. 그 다음 추가적인 24시간동안 40℃에서 반응 혼합물을 인큐베이션하고, 원하는 라이게이션 생성물의 수율은 HPLC 적분에 의해 측정된 것과 같이 생성물과 비-반응 C-말단 절편간의 비율에 기초하여 측정하였다. 관찰된 수율은 약 40%였다. 실시예 11: C-말단 SDF1-알라닌-티오에스테르 및 N-말단 Nα 1-(4-메톡시페닐) 2-머캅토에탄 글리신-펩티드의 Ala-Gly 화학적 라이게이션 5-원 재배열 라이게이션을 위하여, SDF1의 C-말단 알라닌-티오에스테르 절편 (MW 4429) 1 mg, 및 Nα 1-(4-메톡시페닐) 2-머캅토에탄기를 포함하는 N-말단 글리신을 가진 N-말단 펩티드 모델 (MW 2122) 1mg을, pH 7.0인 100㎕의 6 M 구아니디늄 완충용액 [및 1㎕의 티오페놀]에 용해하였다. 반응 혼합물은 실온 (~25℃)에서 인규베이션하였고, 라이게이션 반응을 모니터링하였다. 8시간 후, 원하는 라이게이션 생성물 (MW 5515)의 형성은 ES-MS로 확인하였다. 3일 후, 원하는 라이게이션 생성물의 수율은 생성물과 비-반응 N-말단 절편간의 비율에 기초하여 약 45%였다. 실온에서 3일 후, 추가적인 24시간동안 40℃에서 더 인큐베이션한 다음, 수율은 65%였다. 실온에서 3일 후, 추가적인 48시간동안 40℃에서 더 인큐베이션한 다음, 수율은 약 70%로 증가하였다. 5-원 재배열 라이게이션을 위하여, SDF1-α의 C-말단 Ala 티오에스테르 절편 (MW 4429) 0.5 mg, 및 Nα 1-(4-메톡시페닐) 2-머캅토에탄기를 포함하는 N-말단 글리신을 갖는 N-말단 절편 (MW 2122) 0.5 mg을, pH 8.2인 100㎕의 6 M 구아니디늄 완충용액 및 1㎕의 티오페놀에 용해하였다. 그 다음 실온 (~25℃)에서 반응 혼합물을 인큐베이션하고, 6시간 후에 또다른 1㎕의 티오페놀을 첨가하였다. 24시간 후, 원하는 생성물의 수율은 약 60%였다. 실시예 12: C-말단 글리신-티오에스테르 및 N-말단 Nα-(2-머캅토벤질) 글리신-펩티드의 Gly-Gly 화학적 라이게이션 6-원 재배열 라이게이션을 위하여, 데카머모델 펩티드의 C-말단 Gly 티오에스테르 절편 (MW 1357) 3.5 mg, 및 3 HisDnp를 갖는 모델 펩티드의 N-말단 Nα (2-머캅토벤질) 글리신 절편 (MW 2079) 2 mg을, pH 7.9인 200㎕의 6 M 구아니디늄 완충용액에 용해하고 2㎕의 티오페놀을 첨가하였다. 60시간동안 33℃에서 혼합물을 인큐베이션하였다. 원하는 라이게이션 생성물 (MW 2631)의 형성은 ES-MS로 확인하고, 관찰된 수율은 생성물과 비-반응 N-말단 절편간의 비율에 기초하여 약 40%였다. C-말단 글리신-티오에스테르 펩티드 및 Nα 1-(4-메톡시페닐) 2-머캅토에탄글리신-펩티드의 화학적 라이게이션 5-원 재배열 라이게이션을 위하여, 2 mg의 C-말단 Gly 티오에스테르 절편 (MW 1357) 및 Nα 1-(4-메톡시페닐) 2-머캅토에탄기를 포함하는 3 HisDnp를 갖는 모델 펩티드의 N-말단 절편 (MW 2122) 2.5 mg을, pH 7.0인 100㎕의 6 M 구아니디늄 완충용액 및 1㎕의 티오페놀에 용해하였다. 반응 혼합물을 실온 (~25℃)에서 인큐베이션하고 라이게이션 반응을 모니터링하였다. 원하는 라이게이션 생성물 (MW 2675.9)의 형성은 3시간 및 8시간의 인큐베이션 후 ES-MS로 확인하였다. 24시간 후, 원하는 라이게이션 생성물의 수율은 생성물과 비-반응 N-말단 절편간의 비율에 기초하여 약 40%였다. 그 다음 고체 중탄산나트륨을 첨가하여 pH를 8.2까지 올리고, 추가적인 24시간동안 반응 혼합물을 인큐베이션하여, 88%의 수율을 얻었다. 실시예 13: Nα 1-,(4-메톡시페닐) 2-머캅토 에탄 글리신-펩티드와 Larc-알라닌-티오에스테르의 Ala-Gly 화학적 라이게이션 마우스 Larc 1-31 Ala C-말단 펩티드 티오에스테르 3 mg (MW 3609) 및 모델 펩티드인 Nα 1-,(4-메톡시페닐) 2-머캅토 에탄 글리신-S-Y-R-F-L 1 mg (MW 908)을, pH 8.2인 0.15 ml의 6 M 구아니디늄 완충용액 및 0.03 ml 티오페놀에 용해하였다. 하루밤동안 교반한 후 펩티드 티오에스테르의 소비량에 기초하여 라이게이션은 81% 완료되었고 40시간에는 92% 완료되었다. 기대된 라이게이션 생성물 4312Da, 실측치 4312Da. 실시예 14: Nα 1-(2,4-디메톡시페닐) 2-머캅토 에탄 글리신-펩티드와 Larc 1-31-알라닌-티오에스테르의 Ala-Gly 화학적 라이게이션 마우스 Larc 1-31 Ala C-말단 펩티드 티오에스테르 3 mg (MW 3609) 및 모델 펩티드인 Nα 1-(2,4-디메톡시페닐) 2-머캅토 에탄 글리신-S-Y-R-F-L 1 mg (MW 938)을, pH 8.2인 0.15 ml의 6 M 구아니디늄 완충용액 및 0.03 ml 티오페놀에 용해하였다. 하루밤동안 교반한 후 펩티드 티오에스테르의 소비량에 기초하여 라이게이션은 73% 완료되었고 40시간에는 85% 완료되었다. 라이게이션 생성물의 이론 및 실험 질량은 둘 모두 4342Da이었다. 실시예 15: C-말단 트리펩티드 글리신-티오에스테르 및 N-말단 Nα-1-(2,4-디메톡시페닐) 2-머캅토 에탄 글리신-펩티드의 Gly-Gly 화학적 라이게이션 펩티드 절판 FGG-티오에스테르 0.8mg 및 모델 펩티드 Nα 1-(2,4-디메톡시페닐) 2-머캅토 에탄 글리신-S-Y-R-F-L 1mg (MW 938)을, pH 8.2인 0.1ml의 6 M 구아니디늄 및 0.02ml의 티오페놀에 용해하였다. 하루밤동안 교반한 후 반응은 양적으로 종료하였다. 라이게이션 생성물의 이론 및 실험 질량은 각각 1199.4Da 및 1195.5Da이었다. 실시예 16: 라이게이션 생성물로부터 1-(2,4-디메톡시페닐) 2-머캅토 에탄의 제거 실시예 15의 정제된 라이게이션 생성물 1mg을 0.95ml의 TFA 및 0.025ml의 물 및 0.025ml의 TIS에 용해하였다. 1시간 후, 용매를 증발시키고 50%의 물/아세토니트릴 용액을 첨가한 다음 혼합물을 동결건조하였다. 절단은 HPLC에 의해 95% 이상 완료된다. 이론 및 실험 질량은 1003Da이었다. 실시예 17: C-말단 트리펩티드 글리신-티오에스테르 및 N-말단 Nα 1-,(4-메톡시페닐) 2-머캅토 에탄 글리신-펩티드의 Gly-Gly 화학적 라이게이션 트리펩티드 펩티드 절편 티오에스테르인, FGG-티오에스테르 1.6mg 및 모델 펩티드인 Nα 1-(4-메톡시페닐) 2-머캅토 에탄 글리신-SYRFL 2mg (MW 908)을 pH 8.2인 0.2ml의 6M 구아니디늄 완충용액에 용해하고 0.04ml의 티오페놀을 첨가하였다. 하루밤동안 교반한 후 반응은 양적으로 완료하였다. 라이게이션 생성물의 기대된 MW는 1169.4Da이고, 실측치는 1169.5Da이다. 실시예 18: 라이게이션 후 1-(,4-메톡시페닐) 2-머캅토 에탄기의 제거 실시예 17의 정제된 라이게이션 생성물을 -2℃에서 1시간동안 HF 5% p크레졸로 처리하였다. HF 증발 후, 에테르로 라이게이션 생성물을 침전시켰다. 조 펩티드를 50% 물/아세토니트릴 0.1% TFA에 녹이고 HPLC상에 주입하였다. >80%인 주요 최고점은 절단된 펩티드에 대한 기대된 분자량을 나타냈다 (기대량 1003Da, 실측치 1003Da). 실시예 19: C-말단 히스티딘-티오에스테르 및 N-말단 Nα 1-(2,4-디메톡시페닐) 2-머캅토 에탄 글리신-펩티드의 His-Gly 화학적 라이게이션 펩티드 절편인 TBP-A 1-67 CαHis 티오에스테르 4mg 및 모델 펩티드인 Nα 1-(2,4-디메톡시페닐) 2-머캅토 에탄 글리신-S-Y-R-F-L 1mg (MW 938)을 pH 8.2인 0.1ml의 6M 구아니디늄 및 0.02ml의 티오페놀에 용해하였다. 하루밤동안 교반한 후, 반응은 펩티드 티오에스테르의 소모량에 기초하여 87% 완료되었다. 라이게이션 생성물의 기대 분자량은 9220Da이고, 실측치는 9220Da이었다. 실시예 20: 라이게이션 후 1-(2,4-디메톡시페닐) 2-머캅토 에탄기의 제거 H-G 라이게이션 후 정제된 펩티드 2mg을 0.95ml의 TFA 및 0.025ml의 물 및 0.025ml의 TIS에 용해하였다. 1시간 후, 용매를 증발시키고 50%의 물/아세토니트릴 용액을 잔류물에 첨가한 다음 혼합물을 동결건조하였다. 절단은 HPLC에 의해 90% 이상 완료된다. 기대 MW는 9023Da, 실측치는 9024Da이었다. 실시예 21: 확장된 천연 화학적 라이게이션에 의한 시토크롬 b562의 합성 3mg의 시토크롬 1-63 C-말단 티오에스테르 MW 7349 0.4μmol 및 1.5mg의 N-말단 Nα 1-,(4-메톡시페닐) 2-머캅토 에탄 글리신 시토크롬 b562 잔기 64-106 MW 4970 0.3μmol을 촉매로서 0.002 ml의 티오페놀을 가진 0.1ml의 6M 구아니디늄 라이게이션 완충용액 pH 7에 용해하였다. 도 5a를 참조한다. 24시간 후 0.025ml의 2-머캅토 에탄올을 혼합물에 첨가하고 45분동안 반응하도록 한 다음, 15mg의 TCEP를 첨가하고 추가적인 30분동안 교반한 후에 반-예비 HPLC 상으로 로딩하였다. 돌파점을 용출한 후 그 다음 혼합물을 탈염하고 65% B로 구배를 올림으로써 라이게이션 혼합물의 모든 성분을 용출하여 하나의 바이알에 수집하였다. 라이게이션에 나타난 탈염된 물질의 분석적 HPLC는 C-말단 펩티드의 소모량에 기초하여 90%보다 더 컸다. HPLC는 11,946Da의 이론 및 기대 질량을 가진 두 개의 주요 최고점 (부분입체 이성질체)을 나타냈다. 도 5b 및 6a를 참조한다. 시토크롬 b562 (1-106)에 대한 아미노산 서열은 아래 나타난다: ADLEDNMETL NDNLKVIEKA DNAAQVKDAL TKMRAAALDA QKATPPKLED KSPDSPEMKD FRHGFDILVG QIDDALKLAN EGKVKEAQAA AEQLKTTRNA YHQKYR (SEQ ID NO:1) 이론 질량 (평균 동위원소 조성) 11780.3Da N-말단기: 수소 C-말단기: 유리산 MH+ 단일동위원소 질량 = 11774.0088 amu HPLC 지수 = 249.80 MH+ 평균 질량 = 11781.2781 amu Bull & Breese 수치 = 1.5360 원소구성비: C508 H830 N147 O168 S3 사용자-정의 아미노산 잔기: B-HisDNP 실시예 22: 라이게이션된 시토크롬 b562 잔기로부터 1-,(4-메톡시페닐) 2-머캅토 에탄기의 제거 및 천연 단백질의 생성 1-,(4-메톡시페닐) 2-머캅토 에탄기의 제거에 앞서 탈염된 용액을 동결건조하였다. 동결건조한 물질은 -2℃에서 1시간동안 HF 95% 5% 아니졸 및 1mmol의 시스테인 (121 mg)으로 처리하였다. 표준 프로토콜을 이용하여 HF를 증발시킨 다음 100 ml의 50% 완충용액 B를 첨가하고 혼합물을 동결건조하였다. 그 다음 반-예비 HPLC를 이용하여 혼합물을 정제하고, 이론 및 실험 질량이 11,780Da인, 2mg의 정제된 단일 최고점 천연 시토크롬 1-106을 얻었다 (정제 후 56%의 수율). 도 6b 및 7a를 참조한다. 야생형 시토크롬 b562의 유사체 또한 동일한 수단으로 합성하여, Slm7 cyt b562로 표시하였다. Slm7 cyt b562 돌연변이체는 위치 7에 있는 메티오닌을 셀레노메티오닌 (메티오닌의 황이 그것의 저급 코지너 셀레늄으로 대치됨)으로 대치함으로써 야생형과 구별된다. 원편광 2색법을 수행하였는데 이는 아포 야생형 b562 및아포 Slm7 b562 모두에서 높은 α-나선의 함유량을 나타낸다 (데이터는 나타내지 않음). ESMS 또한 아포 야생형 b562 및 아포 Slm7 b562 모두 기대된 분자량을 갖는다는 것을 나타냈다 (데이터는 나타내지 않음). 아포 단백질은 헴으로 재구성하고 (헴 pH7 NaPi 하룻밤동안 실온에서), 결과적 단백질은 이온 교환 FPLC (FPLC 정제 Resource Q, Tris HCl pH 8, NaCl 구배)로 정제하였다. 예를 들어, 도 7b를 참조한다. 헴-재구성 단백질의 UV-가시화 (시각적) 분광은 철에 대한 황 또는 셀레늄 배위 결합과 일치하는 것으로 나타났다 (데이터는 나타내지 않음). 비-배위 결합 등량흡착 노르류신을 가진 cyt b562 돌연변이체 또한 동일한 수단으로 제조하였다. 그러므로 합성 시토크롬은 그것의 헴 활성 부위로 재구성되고 생물물리학적 방법으로 완전히 특성결정된, 확장된 천연 화학적 라이게이션을 이용하여 제작하였다. 따라서, 이러한 예는 나아가 원래의 천연 화학적 라이게이션 접근법을 위한 적당한 시스테인이 결여된 펩티드 및 단백질은 확장된 천연 화학적 라이게이션 및, 거기에 수록된 표준 아미노산에 의해 제작될 수 있다는 것을 설명한다. 예를 들어, 수많은 cyt b562 돌연변이체의 폴딩 및 재활성화는 연구되었으나, 더 많은 비자연적 축 리간드는 밝혀지지 않은 채로 남아있다. 확장된 천연 화학적 라이게이션과 더불어, 이용가능한 비자연적 아미노산의 광범위한 정렬은 이들 및 다른 단백질 성질의 합성 조율을 허락할 수 있다. 실시예 23: Nα 1-,(4-메톡시페닐) 2-머캅토 에탄 글리신-펩티드와 MCP 1-35-리신-티오에스테르의 Lys-Gly 화학적 라이게이션 MCP 1-35 Lys C 말단 펩티드 티오에스테르 3mg 및 모델 펩티드 Nα 1-,(4-메톡시페닐) 2-머캅토 에탄 글리신 S-Y-R-F-L 1mg (MW 908)을, pH 7인 0.15ml의 6몰 구아니디늄 완충용액에 용해하고 트리에틸아민 및 0.15ml의 티오페놀을 첨가하여 pH 7.2로 조절하였다. 하루밤동안 교반한 후 라이게이션은 펩티드 티오에스테르의 소모량에 기초하여 69% 완료되고 40시간 후에는 76% 완료되었다. 기대된 라이게이션 생성물은 4893Da, 실측치는 4893Da이다. 실시예 24: 라이게이션 후 1-(,4-메톡시페닐) 2-머캅토 에탄기의 제거 실시예 23의 동결건조된 탈-염 조 생성물을 1mg의 TFA, 25㎕의 에탄 디 티올, 50㎕의 TIS에 용해하였다. 그 다음 150㎕의 브로모트리메틸실라인을 첨가하였다. 실온("rt")에서 2시간동안 반응이 진행되도록 하였다. 혼합물의 휘발 성분은 진공에서 증발시키고, 남아있는 오일은 pH 7.5인 6M 구아니디늄에 녹였다. 유기 물질은 CHCl3로 추출하였다.다.LC는 더 이상의 출발 물질이 없는 것을 나타냈으므로, 보조기를 성공적으로 제거하였다. 천연 서열의 기대량은 4726Da이고, 4725Da의 양을 실측하였다. 실시예 25: GRYRFL 펩티드와 라이게이션 연구의 비교 실시예 13 내지 20 및 24의 GSYRFL 펩티드와 5-원 재배열 라이게이션 연구의 비교는표 5에 요약하였다. 실시예 26: Boc글리신 N-1(4'-메톡시페닐),2(4'-메틸벤질티오)에탄의 제조 4'-메톡시 2(4'메틸벤질티오) 아세토페논 2mmol, 572 mg, 및 글리신 에틸 에스테르 HCl염 2mmol, 139.5 mg을 15ml의 DCM에 현탁하였다. DIEA 6mmol, 1g을 서서히 첨가하고 질소 하에서 1ml의 사염화티타늄 (1M 용액)을 첨가하였다. 실온에서 2일동안 반응을 유지한다. 그 다음 2.5 ml의 무수 메탄올 중 소듐시아노보로히드리드 6mmol, 0.4g을 첨가한다. TLC는 새로운 생성물의 약 40%의 점을 나타내는데 이는 정제 후 NMR에 의해 N-1(4-메톡시페닐),2(4-메틸벤질티오) 에탄 글리신 에틸 에스테르로 정의한다. 그 다음 1mmol 374 mg의 N-1(4-메톡시페닐),2(4-메틸벤질티오) 에탄 글리신 에틸 에스테르를 2ml의 THF에 용해하고 2mmol의 LiOH 수화물 83mg을 용액에 첨가한다. 하루밤동안 교반한 후 에스테르는 완전히 가수분해된다. 진공에서 THF를 제거하고 생성물은 2ml의 DMF에 녹인 다음, 5mmol의 디부틸 디카르보네이트 1.1g을 첨가하고 최종적으로 3mmol의 DIEA, 0.45ml를 첨가한다. 하루밤동안 반응한 후 희석된 HCl 수용액을 첨가하고 최종 생성물은 에틸 아세테이트로 추출한다 (3X). 본 발명이 현재 완전히 설명되었음에도 불구하고, 부가된 청구항의 요지 또는 범위에서 벗어남 없이 많은 변화 및 변경이 가능하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. Claims (81)
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