본 발명은 근적외 분광분석법을 이용한 녹차 함유 데아닌, 가바 및 글루탐산의 개별 함량 동시 측정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 녹차 분말 시료에 근적외선을 조사하여 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산과 관련된 가시-근적외 흡수스펙트럼을 측정하고, 상기 측정한 가시-근적외 흡수스펙트럼을 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 함량 측정 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼과 검증용 가시-근적외 흡수스펙트럼으로 구분한 다음, 상기 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼의 원시 흡수스펙트럼 및 이들의
도함수를 얻고, 통계적 분석을 실시하여 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산 각각의 검량식을 개발한 후, 상기 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼으로 검량식을 보정 및 교차 검증하고, 검증용 가시-근적외 흡수스펙트럼으로 상기 보정 및 교차 검증된 검량식의 적합도를 검증하여 최적의 검량식을 선발하는 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 개별 함량 동시 측정방법에 관한 것이다. 근적외 분광분석법을 이용한 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 개별 함량 동시 측정방법 {Simultaneous measurement method of Theanine, GABA and Glutamic acid individual contents using NIRS in green tea leaves} 본 발명은 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 개별 함량 동시 측정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 근적외선 흡수스펙트럼을 이용하여 녹차 잎에 함유된 데아닌(Theanine), 가바(GABA, γ-Aminobutylic acid) 및 글루탐산(Glutamic acid)의 개별 함량을 동시에 측정하는 방법에 관한 것이다. 차(茶)는 전 세계적으로 물
다음으로 많이 소비되는 음료로서, 여러 대륙의 열대 및 아열대 지역에서 성장한 차나무의 잎으로부터 제조된다. 차의 주요 생산국으로는 인도, 중국, 일본, 한국, 스리랑카, 인도네시아, 베트남, 베네수엘라, 브라질, 조지아, 아제르바이잔, 케냐 등이 있다. 차는 식물학적 형태 및 화학적 성분 면에서 서로 상이한 특성을 나타내는 중국 차(Camellia sinensis)와 아삼 차(Camellia assamica)로 구분하기도 하고, 가공방법에 따라 녹차와 홍차로 구분하기도 한다. 세계 차 생산의 약 20%를 차지하는 녹차는 차 잎에 함유된 대부분의 카테친을 그대로 보존하는 방법인 차 잎 건조에 의하여 제조되는 반면, 세계 차 생산의 약 80 %를 차지하는 홍차는 차 잎에 함유된 카테친이 테아플라빈(TF), 테아루비긴 등과 같은 다른 올리고머로 대부분 산화되어 "발효"된 형태로 제조되는
차이가 있다. 차를 기능과 이에 관여하는 성분으로 구분해 보면 다음과 같다. 먼저, 1차 기능으로는 영양성으로, 이에 관여하는 성분은 비타민류와 미네랄 등이 있다. 2차 기능으로는 기호성으로, 이에 관여하는 성분 중 맛에 해당하는 성분으로는 감칠맛을 내는 데아닌 및 유리 아미노산, 떫은 맛을 내는 카테친, 쓴맛을 내는 카페인 등이 있으며, 향기에 해당하는 성분으로는 테르펜, 알콜, 카보닐, 에스테르 등이 있으며, 색상에 해당하는 성분으로는 플라보놀, 데아플라빈, 카테친 산화물, 클로로필 등이 있다. 또한 3차 기능으로는 생체조절 기능성으로, 이에 관여하는 성분은 폴리페놀, 카페인, 다당체, 비타민, GABA, 미량필수 원소 등이 있다. 차의 2차 기능인 기호성 부분에서 맛에 관여하는 아미노산류는 녹차에 약 25종이 함유되어 있는데, 이들 중 데아닌(theanine, glutamic acid γ-ethyl amide; 5-N-ethyl glutamine)은
비단백태인 유리 아미노산으로 달고 감칠맛에 관여하고, 녹차 아미노산의 60%를 차지하며, 차 맛에 큰 영향을 미친다. 즉, 데아닌은 고소한 맛을 내는 성분으로, 차의 독특한 감칠맛과 향미성분의 주체로서 차의 품질과 밀접한 관계가 있다. 데아닌의 경우 차를 제외한 고등식물에서는 검출되지 않는 차의 독특한 성분으로 다른 아미노산에 비하여 수에서 수백배 많이 함유되어 있다. 또한, 데아닌은 카페인의 작용을 억제하고, 카페인에 의한 중추신경 자극을 방해하는 특이한 작용을 나타낼 뿐만 아니라, 인체 뇌에서 신경보호효과를 담당하는 세로토닌(serotonin), 도파민(dopamine) 및 가바의 함량을 증가시키고, 혈압을 저하시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 한편, 일본에서는 가바 성분이 다량 함유된(혐기처리 차) 가바 차(Gyabaron tea)가 대중적인 인기가 있는데, 이러한 가바 성분은 포유류의 중추신경계에서 가장 핵심적인 억제활성을 가진 중요
신경전달물질이며, 항고혈압 활성을 나타낸다. 또한, 실제 가바가 다량 함유된 차를 경구 투여한 쥐에서 혈압 저하가 증명된 바 있다. 또한, 글루탐산(glutamic acid)은 비필수 아미노산의 일종으로 단백질의 구성 아미노산으로 가장 널리 존재하는데, 녹차에 함유된 데아닌 및 가바 성분의 전구체로 작용하며, 후발효차에 함유된 데아닌 및 가바의 함량에 중요하게 영향을 미치는 아미노산의 일종이다. 녹차의 맛은 상기 데아닌을 포함한 몇몇 아미노산 성분의 함량에 따라 미묘하게 달라지므로, 녹차의 맛에 주요한 영향을 주는 아미노산의 개별적 함량은 녹차의 품질 개선이나 차나무의 육종에 있어 중요한 인자라 할 수 있다. 그러나, 상기한 녹차의 데아닌, 가바 및 글루탐산을 포함한 아미노산류는 화학적 발색단이 없어 일반적인 비색분석이 불가능하다. 최근까지 녹차에 함유된 데아닌을 포함한 아미노산의 함량 측정은 닌하이드린(ninhydrin) 방법을 이용하여 분석되고
있고, 또한 OPA(o-phthaladehyde), PITC(phenylisothiocyanate) 및 뎁실 클로라이드(dabsyl chloride, 4-dimethylaminoazobenzene-4′-sulfonyl chloride)를 이용한 유도체화 방식에 의한 고성능액체크로마토그래피(HPLC)나 모세관전기영동(CE)과 같은 분석방법이 적용되었다. 그러나, 이들 분석방법은 정확성과 정밀성을 가짐에도 불구하고, 전처리가 복잡하고, 분석에 많은 시간이 소요되며, 반응 분석 장비의 구입이나 분석 시료의 추출과 분석 등에 많은 비용이 소요될 뿐 아니라 노동 집약적 분석 방법이라는 단점이 있다. 즉, 상기와 같은 분석법들은 녹차에 함유된 데아닌 및 아미노산의 함량을 분석할 수는 있으나, 다수의 시료를 신속하게 분석하기에는 다소 무리가 있다는 문제가 있다. 따라서, 우수한 차나무를 육종하기 위한 육종 프로그램에 적용하기 위해서나, 계통 평가, 차 잎의 품질 평가
방법의 확립 등 다수의 검체를 분석하기 위해서는 보다 더 신속하고 정확하며, 동시 분석이 가능한 분석 방법이 요구된다. 최근, 개량된 전자-광학 장비의 개발, 스펙트럼 정보를 효율적으로 처리할 수 있는 컴퓨터의 개선, 강력한 통계-분석화학 소프트웨어의 개발로 인해 분광분석 기술의 확대가 촉진되고 있고, 분석 시료로부터 획득한 화학 데이터 및 스펙트럼의 효율적인 관리가 가능해졌다. 그 중에서 특히 근적외 분광분석(NIRS) 기술은 크로마토그래피법과 같은 종래의 함량 평가를 위해 사용되어 온 분광적 정량평가 기술에 비하여 다음과 같은 측면에서 대단히 유리한 특성이 있다. 즉, 근적외 분광분석법은 분석 시간, 비용 및 노동력을 현저히 감소시키면서, 유해한 화학약품의 사용 없이 정량분석이 가능하다. 또한, 근적외 분광분석법은 시료를 파괴하는 일 없이 그 자연적인 형태로 분석할 수 있으며, 다수의 형질을 동시에 분석할 수도 있다. 이러한 특징을 가진 근적외 분광분석법은
기존 습식방법인 화학적 분석에서 도출될 수 있는 문제점을 극복할 수 있는 대안으로서 신속, 정확하고 비파괴적인 방법의 분석도구라고 할 수 있다. 예컨대, Schulz 등은 근적외 분광분석법을 사용하여 녹차 잎에서 알칼로이드와 페놀계 물질을 동시에 분석할 수 있는 방법을 검토한 바 있고, 또 다른 방법으로 FT-NIR 및 다변량 보정법(multivariate calibration method)을 적용하여 녹차에 함유된 카테친의 함량을 분석 보고한 바 있다. 그러나 이들 선행 연구는 단지 녹차 잎에 함유된 카페인과 카테친 함량의 측정에만 유용하며, 녹차에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산의 함량 분석은 불가능하고, 현재까지 근적외 분광분석법을 이용하여 녹차에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산의 개별성분을 동시에 분석한 사례는 없으므로, 이는 차 잎의 개별 아미노산을 측정하기 위한 근적외 분광분석법이 개발되어야 할 다른 이유가 될 수 있을 것이다. 1. 근적외 분광분석법을 이용한 녹차 잎에서 알칼로이드 및 페놀계 물질의 동시 분석 방법, H. Schulz 등, J. Agric. Food Chem. Vol. 47, No. 12, 1999, 5064-5067쪽 2. FT-NIR법을 이용한 녹차(Camellia sinensis (L.)) 카테킨 함량의 동시 분석, Quansheng Chen 등, Food Chemistry 113(2009) 1272-1277쪽 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 녹차에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산의 개별 함량을 동시에 측정할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 기존의 습식방법인 화학적 분석과 비교하여 녹차 데아닌, 가바 및
글루탐산의 개별 함량을 간단한 방법으로 단시간 내에 정확하게 동시 측정할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 차나무 육종 프로그램(breeding program)과 녹차의 품질 개선 및 표준화에 더욱 효과적인 수단이 될 수 있는 녹차 함유 데아닌, 가바 및 글루탐산의 개별 함량 동시 측정방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 새로운 품종의 차나무 육종에 용이하게 적용할 수 있는 녹차 함유 데아닌, 가바 및 글루탐산의 개별 함량 동시 측정방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (S1) 녹차 분말 시료에 근적외선을 조사하여 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산과 관련된 가시-근적외 흡수스펙트럼을 측정하는 단계; (S2) 상기 측정한 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산 관련 가시-근적외 흡수스펙트럼을 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의
함량 측정 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼과 검증용 가시-근적외 흡수스펙트럼으로 구분하는 단계; (S3) 상기 구분한 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 함량 측정 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼의 원시 흡수스펙트럼 및 이들의 도함수를 얻고, 통계적 분석을 실시하여 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산 각각의 검량식을 개발하는 단계; 및 (S4) 상기 (S2)의 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼으로 상기 (S3)의 검량식을 보정 및 교차 검증한 다음, 상기 (S2)의 검증용 가시-근적외 흡수스펙트럼으로 상기 보정 및 교차 검증된 검량식의 적합도를 검증하여 최적의 검량식을 선발하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 개별 함량 동시 측정방법을 제공한다. 상기 (S1)의 가시-근적외 흡수스펙트럼 측정은 400 내지 2,500㎚ 범위의 파장대역의 흡수스펙트럼을 이용하여 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 (S1)의 녹차 데아닌, 가바
및 글루탐산과 관련된 흡수스펙트럼의 측정은 근적외 분광분석장치(NIRS, Near Infrared Spectroscopy), 적외선(IR) 분광장치, 자외-가시광선(UV-VIS.) 분광장치, 로만(ROMAN) 분광장치, 핵자기공명(NMR) 분광장치 등으로 측정할 수 있다. 상기 (S2)의 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 함량 측정 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼과 검증용 가시-근적외 흡수스펙트럼의 구분은, 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 가시-근적외 흡수스펙트럼 반사율의 역수의 로그로 기록된 하나의 데이터와 이웃하는 데이터 간의 거리를 마할라노비스(mahalanobis) 거리(H 거리)로 측정하고, 이의 절사점을 기준으로 무작위 선발하여 이루어지는 것이 바람직하다. 특히, 상기 H 거리는 평균 스펙트럼으로부터 0.6 미만이거나 3.0을 초과하는 범위의 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 가시-근적외 흡수스펙트럼에 해당되는 시료의 데이터를 제거하여 흡수스펙트럼의
경계를 제공하는 것이 좋다. 상기 (S3)의 통계적 분석은 다중선형회귀분석법(MLR: Multiple Linear Regression), 주성분 회귀 분석법(PCR: Principle Component Regression), 부분최소자승법(PLS: Partial Least Squares), 변형부분최소자승법(MPLS: Modified Partial Least Squares) 등의 방법으로 수행될 수 있다. 이상과 같은 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 개별 함량 동시 측정은 시료 당 1분 이내의 단시간 내에 이루어질 수 있다. 본 발명에 따르면 근적외 분광분석법의 적용으로 차나무 육종 프로그램(breeding program)에 효과적인 녹차 함유 데아닌, 가바 및 글루탐산의 개별 함량을 간단한 방법으로 단시간 내에 정확하게 동시 측정할 수 있다. 특히, 본 발명은 시료의 근적외선 흡수스펙트럼의 측정, 분석을 통하여 시료 1점 당 1분 미만의 분석시간으로 녹차 함유 데아닌, 가바 및 글루탐산의 개별 함량을 동시에 측정할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명은, 기존 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산 함량 측정에 이용되던 별도의 고가 분석 장비가 필요 없고, 장시간 소요되던 분석시간을 극히 단축할 수 있으며, 인력, 경비 및 측정오차를 개선할 수 있는 효과가 있다. 또한 본 발명은, 녹차에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산 이외에도 기타 유용 화합물, 카테친, 단백질, 수분, 아미노산, 색도, 관능치 등과 같은 기타 품질 특성을 동시에 분석할 수 있으므로, 녹차의 품질 평가, 우수한 육종 계통의 선발 및 새로운 유전자원의 동정(identification)이 가능하여 새로운 품종의 차나무 육종 프로그램(breeding program)에 적용이 가능하고, 차나무 육종의 개발에 기여할 수 있다. 또한 본 발명은, 신속성, 정확성 및 실시간성이 요구되는 동시분석에 활용이 가능하여 이의 결과를 새로운 품종의 차나무 육종에 편리하게 적용하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명은, 근적외 분광분석기술의 응용범위를 확대할 수 있으며, 장치개발의 중요한 기초기술 분야 등 관련 산업에서 과거에는 상상할 수 없었던 강력한 장점들을 제공할 수 있을 것으로 기대된다. 도 1은 참고예에 따라 기존 습식방법인 화학적 분석에 의해 녹차 추출물로부터 데아닌, 가바 및 글루탐산의 함량을 분석한 HPLC 크로마토그램이다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 이하 본 발명에서 설명하는 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산, 녹차 함유 데아닌, 가바 및 글루탐산은 모두 녹차 잎에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산을 의미하는 것으로, 구체적으로 녹차 잎을 명시하지 않더라도 녹차 잎에 함유된 성분들을 의미하는 것이다. 본 발명은 근적외선 흡수 스펙트럼을 이용하여 녹차 잎에 함유된 데아닌(Theanine), 가바(GABA, γ-Aminobutylic acid) 및 글루탐산(Glutamic acid)의 개별 함량을 동시에 측정하는 방법에 관한 것으로, 이하에서는 본 발명의 녹차 함유 데아닌, 가바 및 글루탐산의 개별 함량 동시 측정방법을 각 단계별로 구체적으로 설명한다. ( S1 ) 녹차 데아닌 , 가바 및 글루탐산 관련 가시- 근적외 흡수스펙트럼 측정 먼저, 임의량의 녹차 분말 시료에 근적외선을 조사하여 녹차에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산과 관련된 가시-근적외 흡수스펙트럼을 측정한다. 상기 녹차 분말 시료는 측정하고자 하는 녹차 잎을 분말화하여 얻을 수 있으며, 녹차 잎의 분말 시료는 400 내지 800개로 조절하는 것이 검량식의 광범위화 및 유의적인 검량식 개발에 있어 적합하다. 녹차 분말 시료의 가시-근적외 흡수스펙트럼 측정은 당업계에서 사용되는 통상적인 가시-근적외 흡수스펙트럼의 측정방법과 동일한 방법으로 이루어질 수 있음은 물론이다. 예를 들어, 측정하고자 하는 녹차 분말 시료에 근적외선을 조사하여 이루어질 수 있으며, 특히 반사방식으로 가시-근적외 흡수스펙트럼을 얻는 것이 바람직하다. 일반적으로 근적외 흡수스펙트럼은 800 내지 2,500㎚ 파장대역의 흡수스펙트럼을 이용하나, 본 발명에서 녹차에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산의 함량을 확인하기 위한 가시-근적외 흡수스펙트럼 측정은 400 내지 2,500㎚ 파장대역의 흡수스펙트럼을 이용하는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명의 실험결과 가시광선 영역인 400 내지 1,100㎚ 파장대역에서 얻어진 흡수스펙트럼에서도 유의적인 정보 제공이 가능하므로 상기와 같은 파장대역의 가시-근적외 흡수스펙트럼을 이용하는 것이 더욱 좋다. 또한, 본 단계에서 녹차에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산 관련 가시-근적외 흡수스펙트럼은 근적외 분광분석장치(NIRS, Near Infrared Spectroscopy), 적외선(IR) 분광장치, 자외-가시광선(UV-VIS.) 분광장치, 로만(ROMAN) 분광장치, 핵자기공명(NMR) 분광장치 등을 사용하여 측정할 수 있다. ( S2 ) 녹차 데아닌 , 가바 및 글루탐산 함량 측정 보정용 가시- 근적외 흡수스펙트럼과 검증용 가시- 근적외 흡수스펙트럼 구분 상기와 같이 측정된 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산 관련 가시-근적외 흡수스펙트럼은 이후 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 함량 측정을 위한 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼과 검증용 가시-근적외 흡수스펙트럼으로 구분한다. 상기 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼과 검증용 가시-근적외 흡수스펙트럼의 구분은 다양한 통계적 분석기법을 적용하여 최적의 검량식을 개발, 보정 및 검증하기 위하여 실시하는 것이다. 이러한 구분은, 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 가시-근적외 흡수스펙트럼 반사율의 역수의 로그로 기록된 하나의 데이터와 이웃하는 데이터 간의 거리를 마할라노비스(mahalanobis) 거리(H 거리)로 측정하고, 이의 절사점(cutoff point)을 기준으로 무작위 선발하여 이루어진다. 특히, 본 발명에서는 상기 H 거리가 평균 스펙트럼으로부터 0.6 미만이거나 3.0을 초과하는 범위의 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 가시-근적외 흡수스펙트럼에 해당되는 시료의 데이터를 제거하여 흡수스펙트럼의 경계를 제공함으로써 보다 정확하고 확실한 검량식 개발이 가능하도록 한다. 이렇게 구분된 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼과 검증용 가시-근적외 흡수스펙트럼을 위한 시료 수는 근적외 분광분석법에 사용되는 군집(population) 시료의 스펙트럼 변화 및 화학적 변화에 따라 변화될 수 있으며, H 거리의 절사점(cutoff point)을 기준으로 결정될 수 있다. 본 발명에서는 총 485개의 시료 중 H 거리가 0.6 미만이거나 3.0을 초과하는 38개의 시료를 제거한 나머지 447개 시료의 스펙트럼을 이용하여 무작위로 분할하여 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼(265개의 시료)과 검정용 가시-근적외 흡수스펙트럼(182개의 시료)으로 구분하였으며, 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼은 검량식의 보정 및 교차 검증에 사용하고, 검증용 가시-근적외 흡수스펙트럼은 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼에 의해 보정 및 교차 검증된 각각의 검량식의 적합도를 검증하기 위한 외부 검증용으로 사용하였다. ( S3 ) 검량식 개발 전술한 바와 같이 구분된 녹차 함유 데아닌, 가바 및 글루탐산의 함량 측정 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼을 사용하여 원시 스펙트럼과 이의 도함수를 얻고, 수학적 처리 및 통계적 분석을 실시하여 녹차 함유 데아닌, 가바 및 글루탐산 각각의 검량식을 개발한다. 가시-근적외 흡수스펙트럼의 측정 시 검체 내, 외부의 성분에 의한 영향, 기준선(baseline)의 이동과 시스템의 잡음(noise), 검체 처리과정의 분석 오차가 유발될 수 있는데, 이러한 문제들은 수학적 처리와 다양한 통계적 분석을 통하여 보정할 수 있고, 검량선을 안정하게 하여 정량 및 정성분석의 필수적인 도구로 사용할 수 있다. 일반적으로 스펙트럼의 보정 및 분석을 위해서는 도함수의 수학적 처리(미분), 평활화(smoothing), 통계적 분석 등의 방법이 사용된다. 스펙트럼의 수학적 처리인 미분(differential)은 측정시의 환경변화나, 측정 장치의 변화 등에 의해 야기된 기준선의 이동을 제거하고, 분석 대상 성분의 스펙트럼 정보가 다른 주성분의 스펙트럼 정보에 의해 보이지 않을 경우, 이를 강조하기 위해 사용된다. 가시-근적외 흡수스펙트럼에 사용되는 수학적 처리로는 1차 이상의 미분을 활용한다. 스펙트럼의 미분은 모든 자료의 기준선을'0'으로 한 다음 각 스펙트럼의 기울기를 계산하는 것으로, 스펙트럼의 1차 미분은 단순히 모든 파장에서 접선의 기울기를 측정하는 것이며, 접선의 기울기는 기준선의 이동에 영향을 받지 않으므로 기준선 이동에 따른 영향을 효과적으로 제거할 수 있다. 또한 2차 미분은, 스펙트럼 곡선에서의 기울기 변화의 특성을 나타내며 기준선 보정과 함께 시스템의 잡음 등으로 나타나는 오차를 제거하는데 효과적으로 사용되기도 한다. 또한 평활화(smoothing)는 스펙트럼 신호의 외란 요인 중 측정센서 자체의 잡음을 제거하기 위한 수치 연산으로서, 신호 값의 단기적 변이를 완화시키는 효과가 있다. 중첩된 피크를 분리해 내고 기준선의 이동을 제거하는 미분은 잡음의 영향을 많이 받기 때문에 미분에 앞서 평활화를 하는 것이 일반적이다. 한편, 근적외선에서는 스펙트럼의 변위가 미약하기 때문에 검량식의 개발을 위해서는 다양한 통계적 분석이 사용되고 있다. 통계적 분석 중, 다중선형법(Multiple Linear Regression, MLR)은 보통 시료의 구성이 단순할 때 적합하며 측정성분이 독특한 흡수 봉우리를 가질 때 유용하다. 이때 여러 파장에서 스펙트럼의 변위가 원하는 측정성분의 변위에 비례하도록 검량선을 만든다. 주성분 회귀분석법(Principal Component Regression, PCR)이나 부분최소자승법(Partial Least Squares, PLS)은 흡수 봉우리의 중첩으로 스펙트럼이 복잡하여 분석이 어려운 경우 많이 사용되며, 교차검증(Cross-validation)을 이용하는 변형부분최소자승법(Modified Partial Least Squares, MPLS)은 파장의 전대역과 실험치의 상관을 유도하는 과정에서 각 파장변수에 따른 상관도 및 교차검증 결과의 오차를 얻을 수 있으므로, 과다적합(overfitting)화 되지 않는 검량식을 유도할 수 있기 때문에 많이 이용되고 있다. 뿐만 아니라, 빛의 산란은 파장에 따라 일정하지 않으므로 바탕선의 이동, 기울기 변화 등의 원인이 된다. 일반적으로 산란보정을 위해 사용되는 다분산 보정(Multiplicative scatter correction, MSC)은 각각의 스펙트럼을 검체의 이상적인 스펙트럼으로 선형화하여, 빛의 산란 효과를 제거하는 방법이다. 주요점은 모든 스펙트럼이 동일한 이상적 스펙트럼을 통해 보정되어야 하는 것이다. 따라서 산란보정은 스펙트럼 변화와 농도 간에 선형 관계가 존재할 때 주로 사용하고, 분석시료들이 화학적으로 유사한 경우 좋은 결과를 얻을 수 있다. 본 발명에서는 녹차에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산의 함량을 동시에 측정하고자 하는 바, 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산 각각의 특성에 맞도록 최적화된 검량식이 필요하다. 특히, 이러한 검량식의 결정에 의하여 목적하는 각 성분의 함량을 수득함에 있어 편차가 발생하게 되므로, 검량식의 최적화가 무엇보다 중요하다고 하겠다. 따라서 본 발명에서는, 상기 가시-근적외 흡수스펙트럼의 원시 흡수스펙트럼 및 이들의 도함수를 얻고, 통계적 분석을 다양하게 실시하여 최적화된 검량식을 얻은 다음, 미지의 시료에서 얻어진 가시-근적외 흡수스펙트럼을 상기 최적화된 검량식에 대입함으로써 목적하는 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 개별 함량을 단시간내에 정확하게 얻을 수 있게 된다. 상기와 같이 최적화된 검량식을 얻기 위해서 본 발명은 전술한 단계에서 얻어진 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 함량 측정 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼 각각에 도함수(원시, 1차 또는 2차 미분, 산란보정)를 적용한 수학적 처리를 수행하고, 다양한 통계적 분석을 실시한다. 상기 수학적 처리로는 다양한 조건의 평활화 방법과 원시, 1차 또는 2차 미분 방법, 산란보정이 사용된다. 즉, 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 가시-근적외 흡수스펙트럼의 원시 흡수스펙트럼은 여러 요인에 의해 흡광도 이동현상(shift)이 발생되므로, 상기 원시 흡수스펙트럼을 대상으로 1차 또는 2차 도함수를 적용하는 수학적 처리를 하게 되면 모든 가시-근적외 흡수스펙트럼이 동일 기준선에 정렬하게 되어 상기 흡광도 이동현상으로부터 유래되는 시료간의 차이를 배제할 수 있게 된다. 뿐만 아니라, 상기 1차 또는 2차 도함수를 산란보정(scatter correction)함으로써 시료의 경로 길이 및 입자 크기와 같은 물리적 특성에 따른 스펙트럼의 차이를 감소시킬 수 있다. 이같은 산란보정의 방법으로는 SNVD, SNV only, Detrend only, Standard MSC, Weighted MSC, Inverse MSC 등이 사용될 수 있다. 또한, 얻어진 모든 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 함량 측정 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼 결과들을 2㎚ 간격으로 400 내지 2,500㎚ 파장대역에서 근적외선을 조사하여 얻어진 반사율의 역수의 로그로 정리하여 얻어지는 데이터를 정렬하여 각 시료간의 유의성을 확인할 수 있도록 할 수 있다. 본 발명에서는, 원시 흡수스펙트럼을 평활화하여 미세한 변동이나 불연속성 등을 제거하고, 이를 1차 미분 또는 2차 미분을 하여 기준선의 이동을 제거하고, 기준선의 보정과 함께 시스템의 잡음 등으로 나타나는 오차를 제거한 후, 1차 또는 2차 도함수의 통계적 분석을 통하여 최적의 검량식을 개발한다. 상기 통계적 분석은 가시-근적외 흡수스펙트럼에서 발생되는 흡수파장의 중첩(overlapping) 때문에 실시하게 되는데, 대부분의 경우 흡수파장이 중첩되기 때문에 중첩되는 파장의 영향을 배제하고, 보다 정밀한 예측을 위해 여러 가지 통계적 스펙트럼 분석기법을 적용하여 가장 우수한 검량식을 개발하기 위하여 실시한다. 이러한 통계적 분석은 그 방법이 특별히 제한되는 것은 아니며, 구체적으로 다중선형회귀분석법(MLR: Multiple Linear Regression), 주성분 회귀 분석법(PCR: Principle Component Regression), 부분최소자승법(PLS: Partial Least Squares), 변형부분최소자승법(MPLS: Modified Partial Least Squares) 등의 방법이 사용될 수 있다. ( S4 ) 최적의 검량식 선발 전술한 바와 같이 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 함량 측정 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼에 수학적 처리 및 통계적 분석을 실시하여 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산 각각의 검량식을 개발한 이후에는, 상기 각각의 검량식을 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼을 사용하여 보정 및 교차 검증한 다음, 검증용 가시-근적외 흡수스펙트럼으로 상기 보정 및 교차 검증된 검량식의 적합도를 검증하여 최적의 검량식을 선발한다. 상기 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼을 사용한 검량식의 보정 및 교차 검증은 다양한 검량식 개발조건에서 얻어지는 서로 상이한 검량식의 상호평가를 위하여 실시한다. 이러한 보정 및 교차 검증의 방법으로는 검량식의 표준오차, 결정계수, 교차검증의 표준오차 등 내부적 검증방법과 같은 검증에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 상기와 같이 검량식을 검증한 후에는 보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼이 아닌 미지의 시료, 즉 검증용 가시-근적외 흡수스펙트럼을 사용하여 데이터를 예측 분석함으로써 다른 시료들의 정확한 분석이 가능한지 적합도를 검증함으로써 최적의 검량식을 선발한다. 상기와 같이 최적화된 검량식은 본 발명에서 목적하는 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 함량을 동시에 보다 정확하게 측정할 수 있도록 한다. 특히, 전술한 바와 같은 본 발명의 근적외 분광분석법에 따르면 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산을 단시간내에 동시 측정이 가능한데, 목적하는 결과를 얻기 위해서는 시료 당 1분 미만, 보다 구체적으로는 30초 내지 1분 미만이 소요된다. 기존 습식방법인 화학적 분석방법은 다양한 분석시약, 숙련된 기술, 분석을 위한 복잡한 전처리 등이 소요되고, 시료 1점 분석에 최소 6시간 이상이 소요되지만, 본 발명에 의한 근적외 분광분석법에 따르면 분석시약이 필요 없고, 숙련된 기술이 요구되지 않는 이점과 단지 1분 이내에 정확한 결과를 얻을 수 있게 되는 것이다. 또한, 동일한 시료를 사용하여 기존의 화학적 분석에 의하여 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산의 함량을 측정하고, 이를 전술한 바와 같은 본 발명의 근적외 분광분석법에 의해 얻어진 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산에 대한 보정 검량식을 적용하여 얻어진 결과와 비교하였을 때, 데아닌에 대한 검량식은 현저하게 높은 정확도를 가지는 것으로 확인되었으며, 가바 및 글루탐산에 대한 검량식은 상대적으로 데아닌에 비해 낮은 정확도를 나타내었으나, 상대적 함량 비교 및 선발을 위한 차나무 육종 프로그램에 적용하기에는 전혀 무리가 없는 것으로 평가된다. 이러한 결과는 근적외 분광분석법을 적용하여 고품질 차나무 품종 개발을 위한 육종 프로그램에 있어서 녹차 잎에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산을 신속히 측정할 수 있음을 나타낸다. 이하에서는 실시예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나. 이들 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 1) 시료 및 전처리 국내,외 녹차 유전자원(Camellia sinensis L.) 총 485개 시료를 (주)장원 설록차 연구소(한국 서귀포 소재)에서 분양받아, 데아닌, 가바 및 글루탐산 함량의 측정을 위한 근적외 분광분석(NIRS) 예측 모델의 개발에 사용하였다. 녹차 잎(fresh green tea leaves)을 제1 수확기(5월) 및 제2 수확기(7월)에 수확하고, 수확 직후 40초 동안 100℃의 스팀 건조오븐(일본 시마다현 소재 Kawasaki사)으로 스팀 처리하여 효소 반응을 억제시키고, 동일한 스팀 건조오븐을 사용하여 1차 건조(100℃에서 40분), 2차 건조(35℃에서 40분) 및 최종 건조(80℃에서 70분)하여 녹차 잎을 가공하였다. 상기 가공된 녹차 잎을 마이크로 해머 밀(스위스 취리히 소재 Culatty AG사 제품)로 분쇄하고, 1.0㎜ 스크린을 사용하여 거른 다음, 사용 시까지 4℃에서 밀봉 플라스틱 백에 보관하였다. 2) 시약 아세토니트릴, 에틸아세테이트, 아세톤 및 1M 염산용액은 Merck Co.(독일 다름슈타트 소재)에서 구입하였다. 데아닌, 가바 및 글루탐산의 분석 표준품, 탄산수소나트륨, 뎁실 클로라이드(dabsyl chloride), 소듐비카보네이트 및 소듐아세테이트는 Sigma-Aldrich Chemical Co.(미국 미주리주 세인트루이스)로부터 구입하였다. 초순수 증류수(ultra pure water)는 Millipore사(미국 메사추세츠주 베드포드 소재)의 Mili-Q 정수기(water purifier system)를 이용하여 가공하였다. 참고예 . 녹차 데아닌 , 가바 및 글루탐산 함량의 화학적 분석( Reference analysis ) 녹차 잎에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산 함량을 분석하기 위하여, 1g의 녹차 잎 분말시료에 증류수 50㎖를 첨가하고, 80℃ 조건의 환류추출기에서 30분 동안 환류 추출하였다. 이 추출물을 상온에서 방냉한 후 일반 여과지로 여과하고, 여과액 30㎖에 1M 염산을 첨가하여 pH를 3으로 보정하였다. pH가 3으로 보정된 30㎖의 추출액을 분획여두에 옮기고, 동량의 에틸아세테이트를 넣은 후 5분 동안 격렬하게 흔들어 방치하여 분획을 실시하였다. 층 분리가 완료된 후 상층의 에틸아세테이트를 폐기하고, 상기 에틸아세테이트를 이용한 층 분리 작업을 2회 더 반복 실시하였다. 총 3회 걸쳐 에틸아세테이트를 이용한 층 분리가 완료된 하층의 물 추출액에 다시 1M의 탄산수소나트륨을 첨가하여 pH를 9로 보정한 후 30㎖의 에틸아세테이트를 넣은 후 5분 동안 격렬하게 흔들어 방치하여 1회의 분획을 실시하고, 아래층의 물 층을 회수하였다. 여기에 1M의 탄산수소나트륨을 첨가하여 pH를 9로 보정한 후 dabsylation 유도체 반응용 추출액으로 사용하였다. 상기와 같이 준비한 각 추출액 및 표준용액 1㎖에 아세톤에 용해된 1㎖의 뎁실 클로라이드 용액을 첨가하여 70℃ 오븐에서 20분간 반응시킨 후 얼음 용액(ice bath)에서 냉각하고, 다시 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 0.45㎛ 나일론 필터로 여과하고 최종 여과된 반응용액 20㎕를 고성능액체크로마토그라피(HPLC)에 주입하여 데아닌, 가바 및 글루탐산의 분석시료로 사용하였다. 녹차의 데아닌, 가바 및 글루탐산의 정량적 함량은 465㎚에서 작동하는 광다이오드 어레이 검출기가 장착된 Agilent 1200 시리즈 HPLC 시스템(미국 델라웨어주 윌밍톤)을 이용하여 분석하였다. 분석용 컬럼은 YMC ODS AM 303 칼럼(5㎛; 250 ㅧ 4.6 ㎜ i.d., Waters사, 미국 메사추세츠주 밀포드 소재)을 이용하였으며, 분석용 컬럼을 보호하기 위해 Nova-Pak C18 가드 컬럼(Waters사, 미국 메사추세츠주 밀포드 소재)을 사용하였다. 칼럼 온도는 30℃를 유지하였으며, 이동상은 용매 A(아세토니트릴:0.045M 아세트산나트륨(sodium acetate, pH 4)=30:70)와 용매 B(아세토니트릴:0.045M 아세트산나트륨(pH 4)=75:25))를 농도구배에 의하여 분석을 실시하였다. 즉, 0~15분까지는 15% 용매 B, 15~35분까지는 15~25% 용매 B, 35~40분까지는 100% 용매 B, 41~50분까지는 15% 용매 B로 조절하였다. 용매 B의 증가는 선형적으로 프로그래밍하였고, 유속은 분당 1.0㎖, 시료 주입량은 20㎕로 하였다. 녹차 데아닌, 가바 및 글루탐산 함량은 농도별로 작성된 각 외부 표준검량곡선(R 2 = 0.999** 이상)에 HPLC 피크 면적을 대입하여 계산하였다. 녹차 물 추출물에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산은 상기와 같이 전처리한 후 뎁실 유도체 반응용 추출액으로 변형하여 HPLC로 분석한 결과, 35분 이내에 녹차 잎에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산이 기준선으로부터 완벽하게 분리가 되는 양상을 나타내었다. 상기 방법에 의해 국내,외 차 유전자원 총 485개 시료의 함량을 분석하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 실시예 1. 녹차 데아닌 , 가바 및 글루탐산 함량의 동시 측정용 보정 검량식 개발 1) 스펙트럼 수집 및 전처리 반사방식의 근적외선 스캐닝 단색화장치인 NIRSystem 모델 6500 (Foss NIRSystems Inc사, 미국 매릴랜드주 실버 스프링 소재)을 사용하여 근적외 분광분석(Near Infrared Spectroscopy, 이하 'NIRS라 함')을 실시하였다. 상기 전치리된 녹차 분말 시료(약 2 g)를 표준 링컵에 넣고 스캔하였다. 반사 에너지의 기준값 보정은 기기 내부에 장착된 표준 세라믹 디스크로부터의 측정값을 이용하여 보정하였고, 각 시료별 연속으로 32회 스캔을 수행하고, 이들의 평균값을 해당 시료의 스펙트럼으로 사용하였다. 각 시료별 스펙트럼 측정 시, 반사 에너지의 기준값 보정을 위해 시료의 측정 전, 후에 각각 표준 세라믹 디스크를 16회 스캔하여 기준값을 보정하였다. 모든 개별 분석시료의 스펙트럼 데이터는 2㎚ 간격으로 400 내지 2,500㎚ 파장대역에서 반사율의 역수 로그(로그 1/R)로 측정하여 시료 당 총 1,050개의 파장별 데이터를 측정하였다. 가시광선 영역과 근적외선 영역인 400 내지 2,500㎚ 파장대역에서의 흡수스펙트럼의 측정은 근적외 분광분석기가 충분히 예열된 후, 각 분석시료의 스캔을 시료 당 1분 이내에 완료할 수 있었으며, 광도 측정 반복성(photometric repeatability, 노이즈 테스트) 및 파장 정확성 테스트를 통하여 NIRS의 안정성을 확인한 후 실시하였다. 분석 시료의 스펙트럼 측정을 위한 스캔 작업, 수학적 처리 및 통계 분석을 위한 소프트웨어는 WinISI II(윈도우 1.50 버전, Foss and Infrasoft International LLC사, 미국 펜실베이니아주 스테이트 칼리지 소재)를 사용하여 수행하였다. WinISI 소프트웨어에서, 스코어 프로그램(score program)을 사용하여 보정 및 검증 전에 전체 시료 세트(n=485)를 대표하는 시료들을 선발하고, 일부 스펙트럼 범위 밖의 시료는 제거하였다. 즉, 하나의 시료와 이웃하는 시료 사이의 거리를 마할라노비스(Mahalanobis) 거리(H 거리)로서 측정하고, 보정 및 검증 세트를 대표하는 시료들을 선택하는 기준으로서 사용하였다. 평균 스펙트럼으로부터 H 거리에 따라 최근접 이웃 시료들로부터 H < 0.6인 유사 스펙트럼을 갖는 시료들과 H > 3.0인 범위 밖의 시료들을 제거하였다(총 38개 시료 제거). 보정 및 검증을 위한 시료의 최종 수는 NIRS에 사용되는 군집(population) 시료의 스펙트럼 변화 및 화학적 변화에 따라 변화될 수 있으며, H 거리의 절사점(cutoff point)을 기준으로 하여 결정하였다. 상기 총 485개 시료 중 제거된 스펙트럼을 제외한 나머지 447개 시료의 스펙트럼을 이용하여 WinISI 프로그램에서 두 세트로 무작위로 분리하였다(보정용 가시-근적외 흡수스펙트럼: 265개 시료/검증용 가시-근적외 흡수스펙트럼: 182개 시료). 상기 분리된 보정용 세트(265개의 시료)를 사용하여 검량식을 개발하고, 보정 및 교차 검증을 실시하였으며, 나머지 다른 182개의 시료(검증용 세트)를 외부 검증용 세트로 사용하여 개발된 검량식의 적합도를 테스트하였다. 2) 데이터 처리 WinISI 소프트웨어의 글로벌 프로그램을 사용하여, 2㎚ 간격으로 얻어진 전체 가시광선(400 내지 1,100㎚) 및 근적외선(1,100 내지 2,500㎚) 파장대역의 스펙트럼에 대한 통계적 분석으로 변형부분최소자승법(MPLS)의 회귀 분석방법을 적용하여 녹차 잎에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산 함량에 대한 검량식을 개발하였다. 원시 흡수스펙트럼(raw spectrum)에 대한 각종 수학적 처리(로그 1/R 또는 1/R 데이터의 1차 또는 2차 도함수(first- or second-derivative))를 검량식 개발에 적용하였다. 예컨대, 1,4,4,1에서 첫번째 수는 도함수의 차수를 나타내고(1은 로그 1/R의 1차 도함수임), 두번째 수는 데이터 점들의 간격으로서 이것에 의하여 도함수가 계산되며, 세번째 및 네번째 수는 각각 제1 및 제2 평활화(smoothing)에 사용되는 데이터 점들의 수를 나타낸다. 1차 도함수 및 2차 도함수 알고리즘을 원시 흡수스펙트럼(raw spectrum)에 적용하면 원시 흡수스펙트럼에서 중첩된 피크들을 명백하게 분리할 수 있다. 상기와 같이 도함수에 의해 수학적 처리된 1차 또는 2차 도함수에 빛의 산란보정을 위해 다양한 산란보정(scatter correction) 방법(none, SNVD, SNV only, Detrend only, Standard MSC, Weighted MSC 및 Inverse MSC)이 사용되었다. 원시 흡수스펙트럼 데이터에 다양한 산란보정 변환(scatter correction transformation)을 적용하면 시료의 경로 길이 및 입자 크기와 같은 물리적 특성에 관한 스펙트럼 차이가 감소된다. 계산된 검량식은 검량식 표준오차(SEC), 결정계수(R 2), 및 교차 검증의 표준오차(SECV)로 평가하였다. 다양한 검량식 개발조건에서 얻어지는 서로 상이한 검량식의 상호평가는 내부적 검증 방법과 같은 교차 검증에 의해 판정하였다. 내부 교차 검증을 이용하여 각 모델에서 최소수의 PLS 조건을 선택함으로써 검량식의 과다적합화(overfitting)를 회피하였고, 각 성분에 대한 최적 검량식은 SECV가 낮고, R 2는 높은 것을 기준으로 선택하였다. 검량식에서 벗어나는 이상점(outlier)을 제거하기 위해 WinISI 소프트웨어에서 두 종류의 방법, 즉 t 및 H 통계(마할라노비스 거리)를 사용하였다. RSC로 표시되는 SECV에 대한 습식 분석 데이터(reference data)의 표준편차(SD) 비율(SD/SECV)을 보정 검량식의 예측 결과를 비교 평가하는 기준으로도 사용하였다. 검량식의 작성 후, 각 검량식은 검량식의 개발에 사용하지 않은 미지의 시료인 검증용 흡수스펙트럼(n=182)을 사용하여 다른 시료들의 정확한 분석이 가능한가를 평가함으로써 상기 개발된 NIRS 검량식의 예측 정확성을 검증하였다. 이때, NIRS 검량식의 정확성 검증은 WinISI 소프트웨어의 모니터 프로그램을 이용하여 모니터링하였다. 또한, 상기 내부 교차 검층 이외에, 검량식 모델의 외부적 검증으로 예측 표준오차(SEP) 및 예측 시 결정계수(r 2)를 기초로 한 예측 가능성을 평가하였다. 또한 예측된 SEP(RSP로 표시)에 대한 검증시료의 SD 비율을 검량식의 정확성을 평가하기 위한 기준으로서 사용하였다. 3) 분광분석(Spectroscopic Analysis) 결과 녹차 분말 시료의 원시 흡수스펙트럼을 도 2에 나타내었고, 녹차 분말 시료 중 데아닌의 함량이 높은 시료(5.91%)와 낮은 시료(0.32%)의 수학적 처리에 따른 흡수스펙트럼을 비교한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 의하면 원시 흡수스펙트럼에서는 400~1,500㎚, 1,900~1,974㎚의 파장대역에서 데아닌 함량이 높은 시료가 흡광력이 낮은 양상을 나타내었고, 그 외의 파장대역에서는 데아닌 함량이 높은 시료가 낮은 함량의 시료보다 흡광력이 높은 양상을 나타내었다. 특히, 근적외선 영역 중 1,500~2,500㎚ 사이의 파장대역에서는 데아닌의 함량 차이에 따른 흡광력에 분명한 차이를 확인할 수 있었다. 또한, 1차 및 2차 미분처리한 도함수 스펙트럼에서도 1,870~2,020㎚ 사이의 파장대역에서 데아닌의 함량 차이에 따른 흡광력의 분명한 차이를 확인할 수 있었다. 또한, 녹차 분말 시료의 1차 도함수 스펙트럼 및 평균 표준편차(SD) 스펙트럼은 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 1차 도함수 스펙트럼에 산란보정(scatter correction)으로 Inverse MSC를 이용하고, 1,4,4,1의 수학적 처리에 의한 1차 미분 스펙트럼으로부터 계산하였다. 평균 SD 스펙트럼에서 서로 차이를 나타내는 상이한 주요 흡수 밴드는 주로 근적외선 영역(1,100~2,500㎚)에서 관측되었는데, 1,390㎚에서는 CH2에 관련된 C-H 흡수 밴드가, 수분 및 알콜기의 O-H 1차 배음 또는 지질의 C-H 관능기에 관련된 흡수밴드가 1,412㎚에서, 전분에 관여된 O-H기의 신축 1차 배음이 1,456㎚에서, 방향족 C-H기와 관련된 신축 1차 배음이 1,682㎚에서, COOH 및 Carboxylic acid ester(COOR)에 의한 C=O의 신축 2차 배음에 관련해서는 1,896㎚ 및 1,948㎚에서, 1,982㎚에서는 Carboxamide(CONH2)와 관련된 N-H기의 신축진동이, 2,104㎚에서는 Carboxyl(COO)기 유래 3차 배음이, 2,160㎚에서는 CONHR기와 관련된 N-H기 2차 배음의 흡수 밴드가 관찰되었다. 평균 SD 스펙트럼에서, 몇몇 높은 표준 편차를 나타내는 스펙트럼 영역은 아미노산에 관련된 화학적 관능기(방향족 C-H, COOH, Carboxylic acid ester(COOR), Carboxamide(CONH2) 및 CONHR기)와 밀접한 관계가 있으며, 이들 영역은 데아닌, 가바 및 글루탐산을 포함한 녹차 아미노산의 NIRS 검량식 작성에 중요한 역할을 하였으며, 스펙트럼에서 관능기에 대한 정보는 WinISI 소프트웨어로 측정하였다. 한편, 보정용 시료 세트(calibration sample set) 및 검증용 시료 세트(validation sample set)에 사용된 녹차 분말 시료의 데아닌, 가바 및 글루탐산 함량에 대한 평균, 표준편차(SD) 및 함량범위(range)를 포함하는 기술적 통계 자료(descriptive statistics)는 하기 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이 비교적 큰 편차를 보였다. 이 같은 결과를 통하여 향후 광범위한 함량 범위의 시료에 적용이 가능할 것임을 기대할 수 있다.
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 녹차의 데아닌, 가바 및 글루탐산의 평균 및 표준편차(SD) 값은 보정용 시료 세트에서 데아닌은 각각 2.0884 및 1.0783%, 가바는 각각 0.0375 및 0.0332%, 글루탐산은 각각 0.1231 및 0.0583%로 나타났다. 한편, 검증용 시료 세트에서는 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 녹차의 데아닌, 가바 및 글루탐산의 각 통계치는 보정용 시료 세트에서의 데아닌, 가바 및 글루탐산의 각 통계치와 유사한 양상을 나타내고 있음을 확인할 수 있다. 4) 검량식 모델(calibration model) 개발 녹차의 데아닌, 가바 및 글루탐산 함량에 대한 NIRS 검량식 모델의 검량식 작성 통계는 하기 표 3에 나타내었다.
각 성분에 따라 차이는 있으나, 가시-근적외선 영역(400~2,500㎚)의 원시 흡수스펙트럼에 원시 혹은 1차 도함수 변형, MPLS 회귀 모델(regression model)의 적용 및 서로 다른 산란보정을 하였을 경우, 기타 회귀모델을 적용하였을 때와 비교하여 최적의 검량식을 도출할 수 있었다. 그 결과로서, 글루탐산을 제외한 데아닌 및 가바에 대해서는 R 2 > 0.9 이상이고, 상당히 낮은 SEC를 나타내었으며, 교차 검증에 있어서도 높은 1-VR 값과 낮은 SECV 값을 나타내었다. 또한 전체 가시-근적외선 영역(400~2,500㎚)을 사용할 경우, 가시광선 범위(400~1,100㎚) 또는 근적외선 범위(1,100~2,500㎚)보다 더욱 양호한, 즉 더 높은 R 2 와 더 낮은 SEC 값이 수득되었다. 녹차 잎에 함유된 성분 중 데아닌 및 가바는 다른 기타 수학적 처리보다 1,4,4,1의 수학적 처리를 적용하였을 때가, 글루탐산의 경우에는 원시 스펙트럼인 0,0,1,1의 수학적 처리를 적용하였을 때 모델의 선택 기준이 되는 R 2 및 RSC(SD/SECV) 값이 더욱 향상되어지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 녹차 잎에 함유된 데아닌 및 가바 함량에 대한 신뢰성 있는 검량식은 높은 R 2(> 0.90) 값 및 RSC(> 2.42) 값을 가지므로, 도 1에 나타낸 HPLC에 의해 분석된 표준 분석 함량과 NIRS로 추정된 값 사이에는 고도로 유의한 상관관계가 있음을 확인할 수 있다. 녹차 잎에 함유된 성분인 데아닌 및 가바 검량식은 R 2 값이 0.90 이상이고, SEC 값이 낮아 매우 우수한 정확성을 가졌다. 그러나, 글루탐산에 대한 검량식 모델은 R 2 < 0.90로 상대적으로 다소 낮은 결과를 나타내었는데, 이는 보정용으로 사용된 시료의 함량에 대한 다양성이 작고, 함량의 변이 범위가 좁기 때문일 것이다. 본 발명에서, 검량식 작성에 대한 통계로서 1-VR은 R 2과 함께 중요한 평가 인자로 사용하였다. R 2 값이 높은 검량식 모델이라도, 1-VR 값이 낮을 경우 NIRS로 추정된 함량은 습식방법인 화학적 분석에 의한 함량과 큰 차이를 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명에 의한 녹차 데아닌의 검량식은 극히 높은 R 2(< 0.96)를 나타내었는데, 화학적 분석에 의한 데아닌의 함량 분석 결과와 NIRS 검량식에 의해 산출된 데아닌 함량 간의 잔차를 히스토그램으로 비교한 결과 도 5에 나타낸 바와 같이 전체의 85%가 0.3% 미만의 함량 편차를 나타내는 고도의 정밀성을 확인할 수 있었다. 5) 외부검증(External Validation) NIRS 분석에 의하여 개발된 검량식 모델의 견고성(robustness)은 보정용 시료 세트에 포함되지 않았던 182개의 미지시료(검증용 시료 세트)를 사용하여 외부 검증을 통하여 검증하였다. 녹차 잎에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산에 대한 외부 검증의 통계는 하기 표 4에 나타내었다. 또한, 녹차 잎에 함유된 데아닌, 가바 및 글루탐산에 대한 보정용 및 검증용 시료 세트에서 NIRS로 예측되는 값과 HPLC를 이용하여 화학적 분석한 값의 상관성을 비교하여 도 6 내지 8에 나타내었다.
검량식 모델의 신뢰성을 평가하는데 사용되는 인자들은 r 2, SEP(C)(예측에서의 교정된 표준 오차(corrected standard error)) 및 RSP(SD/SEP(C))로, 낮은 SEP(C) 및 높은 r 2와 RSP 값을 기초로 하여 확립된 검량식 모델의 신뢰성 및 정확성을 모니터링할 수 있다. 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 글루탐산에 대한 r 2 및 RSP 값은 상대적으로 낮은 양상을 나타내었는데, 이는 참고예에서 HPLC를 이용하여 화학적 분석한 함량 값과 NIRS로 추정된 함량 값 사이의 상관관계가 다소 낮음을 나타내는 것이다. 반면, 데아닌 및 가바에 대한 예측은 높은 r 2(각각 0.946 및 0.821) 및 RSP 값(각각 4.30 및 2.25)으로 확인되었는데, 이는 참고예에서 HPLC를 이용하여 화학적 분석한 함량 값과 NIRS로 추정된 함량 값 사이에 매우 우수한 고도의 상관관계를 나타내는 것으로, 기존 습식방법인 HPLC를 이용한 화학적 분석을 대신하여 NIRS 분석법을 사용함에 문제가 없음을 보여주는 것이다. 또한 도 6 내지 8을 통하여 알 수 있듯이, 녹차 잎에 NIRS법을 적용할 경우 데아닌 및 가바 함량에 대한 본 발명의 검량식 모델이 정확한 예측능을 가지고 있다는 것을 입증하는 것이며, 나아가 본 발명의 검량식 모델을 일상적 분석에 적용할 경우 차나무 육종에 적용하는데 있어서 전혀 무리가 없는 신뢰성이 있음을 입증하는 것이다. 이상과 같은 결과를 통하여, 녹차에 함유된 데아닌 및 가바의 함량 분석에 있어 NIRS 분석을 이용하게 되면 높은 정확도를 가지고 신뢰성 있는 동시 분석이 가능함을 알 수 있었다. 한편, 글루탐산에 대한 검량식은 상대적으로 다소 낮은 정확도를 나타내었으나, 상대적 함량 비교 및 선발을 위한 차나무 육종 프로그램에 적용하기에는 무리가 없을 것임을 알 수 있었다. 이러한 NIRS법은 유기용매를 사용하는 추출 단계 및 시간 소모적인 크로마토그래피법이 필요하지 않으며, 분쇄 단계를 포함하거나 포함하지 않고 1분 이내에 용이하게 분석되므로 관심 있는 정량적 인자의 분석을 간략화할 수 있다. NIR 스펙트럼으로부터의 정보는 다소 복잡하고 해석이 곤란한 경향이 있으나, 각각의 계량 분석화학 기술(chemometric technique)로 각 시료에 대하여 측정된 파라미터 및 NIR 스펙트럼에서의 편차 사이의 수학적 관계를 확립함으로써 미지의 시료에서 파라미터 값을 예측하는데 사용할 수 있을 것이다. 결과적으로, NIRS 분석은 보정 검량식 작성에 사용된 시료와 유사한 시료에 대해 매우 신뢰성 있는 시료 예측 분석방법임을 알 수 있다. 또한, NIRS의 주요 이점은 관능인자(sensory factor), 기능성 화합물, 단백질, 수분, 아미노산과 같은 품질성분을 동시에 측정할 수 있다는 것이다. 이러한 NIRS의 분석적 특징은 식품의 품질평가, 우수한 육종 계통의 선택 및 새로운 유전자원의 동정(identification)을 위한 중요한 수단으로 사용될 수 있을 것이며, 다수의 시료 분석에 있어서 HPLC 및 GC와 같은 크로마토그래피 분석 방법을 대체할 수 있을 것임을 예측할 수 있다. 비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다. Claims (7)
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