Western blotting의 트랜스퍼 (blotting)는 gel 안에서 분리된 단백질을 전기적으로 gel에서 끌어내어 membrane으로 옮기는 공정입니다. 말하자면 전기영동 gel의 복사본을 만드는 것과 비슷한 느낌입니다. 작업 자체는 간단합니다만, membrane에 transfer 할 때에 얼룩이 있거나 (Gel과 membrane이 밀착하지 않은 경우), 공기가 들어가 일부 부분이 transfer가 안되거나 할 수가 있어서 만족할 수 있는 blotting membrane을 얻는 것은, 숙련된 연구자도 꽤 어렵다고 합니다. 1. 샘플 조제 2. 전기영동 3.
Transfer 4. Blocking 5. 항체 반응 6. Detection 6. Stripping 목적 단백질이 중앙 부분에 오도록 gel의 acrylamide 농도를 선택합니다. Isoform이나 인산화 등 미세한 차이의 이동도를 가진 여러 단백질 밴드를 검출할 때에는 각각의 단백질을 분리할 수 있는 acrylamide 농도 혹은 gradient gel 등을 사용합니다. Gel의 acrylamide 농도가 낮을 경우 전기영동 후 gel이 쉽게 찢어질 수 있어서 blotting 조작 시에 취급이 어렵습니다. 또한 gel의 acrylamide 농도가 높을 경우에는 조작은 쉽지만 transfer 효율이 떨어집니다. 특히 13% 이상의 gel을 사용할 때에는 transfer buffer에 methanol이 포함되면 transfer 효율이 떨어지므로 methanol 농도를 낮추거나 넣지 않도록 합니다. 전기영동을 하는 동안 트랜스퍼 준비를 합니다. Transfer buffers * Methanol은 membrane과 단백질의 결합효율을 높일 수 있습니다. PVDF membrane < 15%, NC membrane <20%로 사용합니다. PVDF membrane * Pore size가 0.2 μm인 membrane을 사용해주십시오. 저분자의 경우 pore size가 크면
membrane을 통해 빠져나갈 수 있습니다. Filter paper * 총 두께가 4~6 mm가 되도록 매수를 조정해주세요. Blocking solution Mini gel size 1장당 50 mL 정도 준비합니다. Washing buffer Mini gel size 1장당 50 mL 정도 준비합니다. Antibody Mini gel size 1장당 5~20 mL 준비합니다. 일반적으로 목적하는 단백질에 대한 primary antibody와 검출용 효소나 형광이 표지된 secondary antibody를 준비합니다. Primary antibody에 직접 표지되어 있는 경우에는 secondary antibody가 필요하지 않습니다. Antibody의 희석률은 antibody 및 검출시약의 첨부문서를 참고하여 결정합니다. 샘플 양이나 시간에 여유가 있는 경우에는 dot blotting으로 적절한 항원의 검출 감도가 되도록 희석률을 검토합니다. 또한 antibody의 의석은 antibody reaction 직전에 진행합니다. Antibody를 희석한 상태로 장시간 두면 활성을 잃을 수 있습니다. 아래 순서에 따라서 transfer 장치에 세팅합니다. Membrane
equilibrium Gel washing Soak filter paper Filter paper PVDF membrane Gel Filter paper Cathode plate를 올린 후, transfer 장치를 세팅한 후 전원을 연결하여 transfer를 시작합니다. 모식도와 같이 cathode plate쪽에 gel이 오고, anode plate 쪽에 membrane이 오도록 포개어 둡니다. 단백질은 음전하를 띄고 있기 때문에 양극쪽으로 이동하며 membrane으로 이동합니다. * Transfer pack “QBlot kit C/M/W“는 filter paper와 membrane의 준비가 필요없습니다(Ready-to-Use). 전용 transfer buffer로 transfer 효율도 높이고, 단시간에 고효율 western blotting이 가능합니다. * 아래 동영상은 tranfser 장치 세팅 방법의 operation video입니다. 참고 바랍니다. 1. Transfer 장치와 전원장치를 연결합니다. 1. 전원장치를 끄고, transfer 장치에서 전원을 분리합니다. 2. Transfer 장치의 상부 전극판을 분리하여 filter paper를 제거하고 blotting membrane을 tweezer로 회수합니다. 3. TBS-T로 blotting membrane을 washing합니다. 4. Blocking solution에 담가서 blocking reaction을 진행합니다. 5. Antibody reaction을 진행한 후 검출시약으로 signal을 검출합니다. 실험 예. Transfer buffer에 따른 차이다양한 transfer buffer로 blotting 후, blotting membrane과 gel을 AE-1340 EzStain AQua (CBB)로 staining한 결과입니다. 기존의 Towbin method로 transfer 하는 것보다 AE-1460 EzBlot, AE-1465 EzFastBlot, WSE-7210 EzFastBlot HMW는 Semi-dry 방식에서도 고효율로 단백질을 transfer할 수 있습니다. AE-1465 EzFastBlot은 약 10분만에 ~150 kDa의 단백질까지 transfer하는 데에 적합하며, WSE-7210 EzFastBlot HMW는 200 kDa 이상의 고분자 단백질도 약 30분만에 Wet transfer와 동등 이상의 효율로 transfer할 수 있습니다. 또한 AE-1460 EzBlot은 단백질 밴드가 퍼지는 현상 없이 sharp한 band로 또렷하게 transfer하여 결과 확인이 가능합니다. |